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猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的单链环状DNA病毒;已知病毒的基因型有PCV1、PCV2和PCV3。2016年Phan TG等[1]利用宏基因组测序发现PCV3,临床上表现为猪皮炎和肾病综合征样(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome-like,PDNS-like)、繁殖障碍和多系统炎症。随着规模化、现代化养殖业的兴起,PCV3等病毒感染性疫病对生猪养殖业的危害越来越严重,防治难度不断加大,但传统防治措施已突显不足,对新的防控技术、特别是安全有效的新型疫苗的需求日益迫切。PCV3 Cap蛋白是PCV3唯一的结构蛋白,免疫原性最强。本研究将优化的PCV3 Cap基因进行克隆,构建重组表达质粒并检测在中间宿主乳球菌NZ3900和终末宿主植物乳杆菌Lp12中的表达,最后将重组植物乳杆菌免疫C57BL/6小鼠检测其诱导的黏膜免疫保护效果。具体研究方法和结果如下:1.植物乳杆菌重组表达载体分子设计与构建合成含有信号肽1320和DCpep(Dendritic cells peptide,树突状细胞靶向肽)以及经植物乳杆菌密码子优化的PCV3 Cap基因DNA,通过PCR扩增和无缝克隆技术,将其连接到表达载体pSIP411上,电转至中间克隆宿主菌NZ3900中,筛选阳性克隆菌,通过克隆PCR和测序鉴定正确后的重组质粒;并电转入植物乳杆菌LP12中进行诱导表达,表达产物经Western blot、间接免疫荧光和流式分析表明,获得阳性结果其阳性率为47.9%,间接免疫荧光进一步证实了抗原在细菌表面表达。2.重组植物乳杆菌表达PCV3 Cap蛋白的优化乳酸菌表达系统因其益生作用和免疫佐剂作用等优势,在未来具有潜在的应用价值。然而该系统相对于原核表达系统其表达量还需提高。为提高重组植物乳杆菌的表达情况,本研究进行了表达条件的优化。结果在SppIP诱导剂为75-125 ng/mL浓度下表达量最高;不同温度下表达量变化差异小;诱导8h时表达量最高;室温96h、传代15代次,仍可稳定表达。3.植物乳杆菌和重组植物乳杆菌的体外特性研究为了验证经过改造后的植物乳杆菌是否改变其本身特性,本研究对其菌体和菌落特性、生长特性和耐酸耐胆盐抗胁迫试验、黏附性试验和DCs细胞的抗原提呈能力进行测定比较。试验证明,重组植物乳杆菌特性并未被改变。4.重组植物乳杆菌免疫C57BL/6小鼠以及免疫效果的检测本研究将C57BL/6小鼠分为3组(阴性对照组PBS、Lp12组和Lp12:pSIP411-PCV3D组),采用灌胃进行免疫,免疫后采集小鼠粪便、血清样品和肠道灌洗液进行ELISA检测,用流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞亚群的表达水平,CCK-8检测脾脏淋巴细胞增殖情况。结果显示:CD4+T淋巴细胞反应中,与PBS组相比,Lp12组和Lp12:pSIP411-PCV3D组呈现轻微的增高,但无统计学差异;CCK-8检测结果表明,与PBS组相比,Lp12组和Lp12:pSIP411-PCV3D组无统计学差异;肠道灌洗液和粪便总SIgA检测表明,肠道灌洗液与PBS组相比,Lp12组和Lp12:pSIP411-PCV3D组出现下降的趋势,粪便中总趋势也是呈现下降,但无统计学差异;抗体水平中总IgG2a显著升高,提示细胞免疫水平增强;Th1、Th2和Th17型细胞因子的变化中试验组Lp12:pSIP411-PCV3D均高于PBS和Lp12对照组。结果表明:Cap蛋白能够在植物乳杆菌Lp12中有良好表达,在小鼠免疫试验中,重组PCV3具有一定激活T细胞介导免疫的效果,但作用机制尚值得进一步探讨。