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犬恶丝虫病(Heartworm disease)又名犬心丝虫病,是由犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)简称犬心丝虫寄生于犬右心室及肺动脉而引起的疾病,偶尔也寄生于腹腔、眼前庭、皮下等部位,其传播媒介为吸血昆虫,呈世界性分布,对犬、猫和野生动物危害严重。感染犬恶丝虫的动物血液内含有犬心丝虫的幼虫-微丝蚴,微丝蚴经蚊类传播,甚至可感染人,导致肺部结节。犬心丝虫病在我国分布较为广泛,一些地区的流行病学调查研究显示,该病的感染率可达40%以上。但是目前缺乏快速、便捷适用于临床现场的检测方法。因此建立一种特异、敏感、快速的免疫学诊断方法对该病的诊断及预防具有十分重要的意义。本研究利用本实验室从犬心丝虫c DNA文库筛选获得的犬心丝虫特异的MTFP基因重组蛋白作为免疫抗原,制备单克隆抗体,之后对MTFP基因蛋白抗原进行定位。利用纯化的犬心丝虫MTFP重组蛋白作为包被抗原建立Dot-ELISA检测方法,并作为T线划线抗原建立胶体金试纸条检测方法,以期为犬心丝虫病诊断提供快速简便的方法。1、抗犬心丝虫MTFP蛋白单克隆抗体的制备:本研究以犬心丝虫MTFP重组蛋白为免疫抗原对BALB/c小鼠进行免疫,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经筛选得到5株阳性杂交瘤细胞株(编号分别为7号、8号、11号、16号和20号)。对其进行亚类鉴定,其中1株(11号)为Ig G1亚型、2株(8号和16号)为Ig G2a亚型、2株(7号和20号)为Ig M亚型。利用亲和层析法对16号株进行纯化,单克隆抗体轻链、重链清晰可见,纯化效果良好,经间接ELISA检测,其腹水抗体效价为2×105。2、MTFP基因蛋白在犬心丝虫的定位:利用抗犬心丝虫MTFP蛋白16号株单克隆抗体,通过激光扫描共聚焦显微镜对心丝虫MTFP蛋白抗原进行虫体定位,发现MTFP基因蛋白表达于成虫虫体的肌层。3、犬心丝虫Dot-ELISA检测方法的建立:以犬心丝虫MTFP重组蛋白为抗原建立犬心丝虫Dot-ELISA检测方法。通过优化反应条件,确定了最佳抗原包被量为0.5μg/片、最佳待检血清稀释度为1:50、最佳酶标抗体稀释度为1:4000。所建立的Dot-ELISA方法敏感性为1:200,且与犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清没有交叉反应。应用所建立的Dot-ELISA方法检测吉林省白城市62份犬血清,结果检出3份阳性样本,阳性率为4.8%。4、犬心丝虫胶体金检测试纸条的研制:利用犬心丝虫MTFP重组蛋白建立了犬心丝虫胶体金试纸条检测方法。经过一系列试验确定了硝酸纤维素膜为Millipore 135s、金标垫为玻璃纤维RB45、样品垫为玻璃纤维SB08、T线蛋白最佳包被浓度为1mg/m L、C线抗体最佳包被浓度为0.5mg/m L。所制备的胶体金试纸条最低检出限为1:8,稳定性试验表明试纸条至少可室温存放2个月,重复性良好,且与犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清没有交叉反应。应用所制备的胶体金试纸条检测吉林省白城市62份犬血清,结果检出4份阳性样本,阳性率为6.4%。从而为犬心丝虫感染的检测提供了新的方法。