论文部分内容阅读
目的:本研究的目的在于探讨儿童感染及非感染幽门螺杆菌血清外泌体的蛋白组分变化。方法:1、收集396例表现为反复发作、无规律性腹痛,或伴有食欲不振、恶心、呕吐、腹胀等消化道症状的儿内科门诊或住院患儿,进行13C尿素呼气试验及电子胃镜检查,活检钳取胃窦黏膜组织,行亚甲蓝染色和H&E染色,然后选取3例幽门螺杆菌阳性慢性胃炎患儿,同期选取3例健康体检儿童,分别设为实验组和健康对照组,均采集静脉血标本2 ml,离心提取血清,置于-80℃超低温冰箱保存,拟用于提取血清外泌体。2、应用美国101Bio PureExo试剂盒提取血清外泌体,采取粒径检测及电镜对外泌体进行鉴定,比较实验组和对照组的外泌体蛋白浓度和数目。3、通过Label-free质谱法鉴定血清来源的外泌体蛋白质,利用蛋白质功能注释富集对鉴定到的蛋白的种类及功能进行生物信息学分析。4、应用STRING数据库查找差异蛋白质间相互作用关系,进行生物功能和疾病分析,探讨差异蛋白在H.pylori感染患儿中的影响。结果:1、慢性胃炎儿童H.pylori感染检出率为33.8%,胃窦部黏膜病理表现为胃黏膜层充血、水肿,胃小凹上皮细胞增生,有大量淋巴细胞、浆细胞浸润,固有膜内可见炎症细胞浸润,炎症细胞可累及黏膜全层的浅表1/3-2/3。2、通过电镜观察到提取的外泌体呈大小较为均一的椭圆形或圆形的囊泡状结构,成团聚集或散在分布,基本与外泌体的形态学特征相符。纳米示踪技术显示外泌体粒径大小在50-150 nm区间,与公认外泌体的粒径大小相符。3、通过质谱法共鉴定到190个蛋白,有显著差异蛋白39个,P值最小的蛋白是HPT、PON1、FN1。蛋白质谱的生物信息学分析显示,有较多的结合黏附、催化活性、抗氧化活性的蛋白在炎症、免疫及代谢通路富集。4、应用STRING数据库查找血清来源的外泌体差异蛋白质,进行生物功能和疾病分析,显示参与的疾病和功能主要包括了对脂质过氧化反应、应激反应、急性炎症反应、蛋白水解调节、内吞作用、防御反应等。5、将差异蛋白输入STRING数据库中,获得差异蛋白相互作用网络图,其中表达水平上调的蛋白APOE、APOA4、FN1、ITIH4、HPR、SAA4及表达水平下调的蛋白PON1位于蛋白互作网的核心区域。这些核心蛋白提示H.pylori感染并不仅仅影响消化道黏膜,且与全身炎症、免疫和代谢密切相关。结论:1、本研究慢性胃炎儿童H.pylori感染检出率偏低。H.pylori在胃黏膜上皮细胞定植可引起胃黏膜长期慢性炎症反应。2、H.pylori感染后,患儿血清外泌体蛋白表达水平发生了变化,可能参与了对脂质过氧化反应、应激反应、炎症反应、蛋白水解调节、内吞作用、免疫防御反应、肿瘤细胞凋亡抑制、再生等代谢过程,可能介导调节全身免疫应答。