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第一部分:呼吸机相关性肺损伤模型建立以及高潮气量机械通气对肺内P2X7受体和cleaved-Caspase-1水平的影响目的:探讨复制呼吸机相关性肺损伤动物模型的方法及条件,通过肺脏大体形态学、湿/干比、病理损伤评分及中性粒细胞趋化程度确认动物模型复制成功,通过免疫组化、蛋白免疫印迹(Western blot)等分子生物学方法检测P2X7和cleaved-Caspase-1在肺组织中的差异表达。方法:选取8周龄、体重250-300克的SPF级雄性SD大鼠30只,随机分为假手术组(S组)、低潮气量组(L组)、高潮气量机械通气组(H组),其中高潮气量组又分为3个亚组(H20,H28,H40),假手术组只进行气管切开,不进行机械通气;低潮气量组给予7ml/kg潮气量的机械通气,高潮气量组的H20亚组给予20ml/kg,H28亚组给予28ml/kg,H40亚组给予40ml/kg潮气量的机械通气,四小时后处死大鼠,取肺组织,行形态学、湿/干比、病理损伤评分,从而筛选最适宜的动物模型建立条件,然后取最适宜组,连同假手术组和低潮气量组通过免疫组化方法检验肺组织中P2X7受体、髓过氧化物酶(MPO)水平,蛋白免疫印迹方法分析肺组织匀浆中P2X7受体、cleaved-Caspase-1水平。结果:1.S组、L组、H20组及H28组大鼠全部存活,H40组大鼠有4只于机械通气2-3小时内死亡。同S组及L组相比,H28组大鼠肺脏普遍充血、水肿,湿/干比增大(S组:4.41±0.18;L组:4.19±0.38;H28组:5.11±0.15,p<0.01);H20组大鼠肺组织大体外观及湿干比变化不明显(4.46±0.31,同S及L组相比p>0.05)。2.同S组、L组大鼠相比,H28组大鼠病理学评分升高(S组:2.08±2.39;L组:2.42±2.38;H28组:5.21±2.21,p<0.05),中性粒细胞趋化程度增高(髓过氧化物酶免疫组化染色计算累计光密度,S组:26.17±8.13;L组:27.12±4.53;H28组:40.06±6.91,p<0.05);H20组大鼠同S组及L组相比,病理学评分差异不显著(3.04±1.78,p>0.05)。3.H28组大鼠肺组织切片中P2X7受体表达水平较S组、L组显著上调(S组:21.29±8.45;L组:21.76±13.31;H28组:29.88±11.54,p<0.05);蛋白免疫印迹显示H28组大鼠较S组及L组大鼠P2X7蛋白表达水平上调(S组:0.531±0.40;L组:0.663±0.31;H28组:1.318±0.69,p<0.01),同时cleaved-Caspase-1水平上调(S组:0.405±0.29;L组:0.847±0.61;H28组:1.662±1.37,p<0.01)。结论:1、应用28ml/kg潮气量进行机械通气4小时,复制呼吸机相关性肺损伤确切,且不造成动物死亡;应用20ml/kg的潮气量造模,肺损伤不明显;应用40ml/kg潮气量造模,易造成大鼠死亡。2、高潮气量机械通气可以导致肺内cleaved-Caspase-1水平升高,中性粒细胞趋化增多。3、高潮气量机械通气可以导致大鼠肺组织内P2X7受体表达水平升高。第二部分:格列本脲预处理对呼吸机相关性肺损伤大鼠肺脏的保护作用及其对肺内cleaved-Caspase-1水平的影响。目的:应用格列本脲腹腔注射对大鼠进行预处理,研究阻滞钾离子外流后大鼠肺损伤是否可以减轻,及其肺组织基因和蛋白水平P2X7受体和cleaved-Caspase-1表达的变化。方法:8周龄SPF级雄性SD大鼠30只,随机分为5组,均进行麻醉及气管切开,麻醉前1小时腹腔注射格列本脲或者等体积溶剂(含50%二甲基亚砜的无菌生理盐水):1.假手术组(S组):腹腔注射溶剂,保留自主呼吸,不进行机械通气;2.低潮气量组(L组):腹腔注射溶剂,给予7ml/kg潮气量机械通气;3.高潮气量组(H组):腹腔注射溶剂,28ml/kg的潮气量机械通气;4.高潮气量+低剂量格列本脲组(P1组):机械通气条件同H组,腹腔注射格列本脲25mg/kg预处理。5.高潮气量+大剂量格列本脲组(P2组):机械通气条件同H组,腹腔注射格列本脲50mg/kg预处理。机械通气4小时后取肺组织,行湿/干比、病理学评分、免疫组化染色、蛋白免疫印迹、定量PCR检测,观察P2X7受体及cleaved-Caspase-1的表达。结果:1.同S组及L组相比,H组大鼠肺组织病理学评分增高(S组:1.63±1.41;L组:1.71±1.20;H组:4.83±2.46,p<0.01),湿/干比增加(S组:4.43±0.17;L组:4.25±0.35;H组:4.93±0.26,p<0.01),同H组相比,格列本脲预处理可以降低湿干比(P1组:4.57±0.10;P2组:4.58±0.15,p<0.05),降低病理学评分(P1组:1.63±1.41;P2组:1.71±1.20,p<0.01)。2.同S组及L组相比,H组大鼠肺组织切片中髓过氧化物酶表达水平增加(累计光密度:S组:26.24±6.65;L组:26.45±4.69;H组:38.82±6.71,p<0.01),P1组及P2组髓过氧化物酶水平同H组相比水平无差异。(P1组:35.53±5.65,P2组:34.42±6.30,p>0.05)。3.同S组及L组相比,H组大鼠肺内P2X7受体水平增加(累计光密度:S组:20.85±7.34;L组:22.41±10.91;H组:29.82±9.83,p<0.01;灰度比:S组:0.80±0.20;L组:0.97±0.24;H组:1.25±0.22,p<0.01),cleaved-Caspase-1水平增加(灰度比:S组:0.17±0.08;L组:0.48±0.13;H组:0.82±0.17,p<0.01);同H组相比,P1组及P2组大鼠肺内P2X7受体水平降低(累计光密度:P1组:29.93±5.70;P2组:24.30±9.44,p<0.01;灰度比:P1组:0.94±0.18;P2组:0.71±0.19,p<0.01;),cleaved-Caspase-1水平降低(P1组:0.67±0.21;P2组:0.39±0.16,p<0.01)。4.同S组及L组相比,H组大鼠肺内P2X7的模板mRNA水平升高(S组:1.31±0.58;L组:1.47±0.50;H组:2.28±0.90,p<0.01),同H组相比,P1组及P2组大鼠肺内P2X7的模板mRNA水平降低(P1组:1.20±0.30;P2组:0.94±0.25,p<0.01);各组大鼠Caspase-1模板mRNA水平无显著差异(p>0.05)。结论:1.应用格列本脲腹腔注射预处理可以减轻高潮气量机械通气造成的大鼠肺损伤,但不能减少肺内中性粒细胞趋化。2.格列本脲预处理可以剂量依赖性的减轻高潮气量所导致的大鼠肺内P2X7受体和cleaved-Caspase-1上调。3.高潮气量机械通气可以造成大鼠肺内P2X7受体模板mRNA水平增加,格列本脲可以剂量依赖性的降低这种效应;高潮气量和格列本脲处理对大鼠肺内Caspase-1模板mRNA水平无影响。第三部分:呼吸机相关性肺损伤发病中P2X7受体活化途径的探索目的:提取呼吸机相关性肺损伤大鼠肺泡细胞,通过对其凋亡、脂质过氧化反应、ATP水平、Pannexin-1半通道水平的测定,探索P2X7受体活化的途径。方法:动物选取、分组及机械通气条件同第二部分,干预剂改为麻醉前1小时腹腔注射甘珀酸,溶剂改为生理盐水,低剂量甘珀酸组(C1组):腹腔注射甘珀酸5mg/kg;高剂量甘珀酸组(C2组):腹腔注射甘珀酸10mg/kg。机械通气4小时后采取腹主动脉血,提取右肺肺泡灌洗液,测定蛋白含量、IL-1β、IL-18、LDH、异前列醇、ATP水平;提取灌洗细胞,测定细胞计数、单核/巨噬细胞百分比、凋亡率;取左肺制备匀浆,Western Blot法测定Pannexin-1、P2X7、cleaved-Caspase-1蛋白以及炎症因子IL-1β、IL-18水平,提取总mRNA,行反转录PCR,测定IL-1β、IL-18模板mRNA水平。结果:1.较S组及L组相比,H组大鼠肺泡灌洗液中蛋白与血清蛋白比上升(S组:0.16[0.05,0.18],L组:0.57[0.51,0.64],H组:0.63[0.50,0.65],p<0.01),LDH含量增加(S组:34.66±15.92,L组:77.72±16.32,H组:143.6±44.08,p<0.01),肺泡灌洗液中肺泡单核/巨噬细胞数量增加(S组:1.07±0.26,L组:0.76±0.22,H组:3.02±0.50,p<0.01),同H组比较,P1组及P2组肺泡灌洗液中蛋白与血清蛋白比下降(C1组:0.46[0.26,0.61],C2组:0.28[0.23,0.35],p<0.01),肺泡单核/巨噬细胞计数下降(C1组:1.89±0.13,C2组:1.27±0.27,p<0.01),LDH含量下降(C1组:128.2±34.76,C2组:70.40±25.53,p<0.01)。2.同S及L组相比,H组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-18和ATP含量升高(IL-1β:S组:2.61±1.33,L组:39.90±8.66,H组:92.42±31.68,p<0.01;IL-18:S组:49.67±34.89,L组:157.4±36.96,H组:433.6±138.2,p<0.01;ATP:S组:17.38±14.29,L组:112.2±68.17,H组:457.2±155.5,p<0.01);同H组相比,C1和C2组大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-18和ATP含量下降(IL-1β:C1组:2.61±1.33,C2组:39.90±8.66,p<0.05;IL-18:C1组:49.67±34.89,C2组:157.4±36.96,p<0.05;ATP:C1组:17.38±14.29,C2组:112.2±68.17,p<0.01)。3.S、L、H三组大鼠肺泡灌洗细胞Yo-pro-1蛋白特异性摄取率无差异,肺组织石蜡切片Tunel染色中阳性细胞数无差异,肺泡灌洗液中异前列醇水平无差异(均为p>0.05)。4.较S组及L组相比,H组大鼠Pannexin-1蛋白、P2X7蛋白及cleaved-Caspase-1水平增加(Pannexin-1:S组:0.41±0.21,L组:0.57±0.15,H组:0.95±0.20,p<0.01;P2X7:S组:0.80±0.20,L组:0.97±0.24,H组:1.25±0.22,p<0.01;cleaved-Caspase-1:S组:0.17±0.08,L组:0.48±0.13,H组:0.82±0.17,p<0.01),IL-1β及IL-18增多(IL-1β:S组:0.53±0.20,L组:1.07±0.20,H组:1.28±0.21,p<0.01;IL-18:S组:0.48±0.25,L组:0.61±0.17,H组:0.89±0.21,p<0.01);同H组相比,C1和C2组大鼠Pannexin-1蛋白、P2X7蛋白及cleaved-Caspase-1水平下降(Pannexin-1:C1组:0.63±0.20,C2组:0.57±0.19,p<0.01;P2X7:C1组:0.94±0.18,C2组:0.71±0.19,p<0.01;cleaved-Caspase-1:C1组:0.67±0.21,C2组:0.39±0.16,p<0.01),IL-1β及IL-18减少(IL-1β:C1组:0.69±0.20,C2组:0.72±0.26,p<0.01;IL-18:C1组:0.78±0.20,C2组:0.71±0.23,p<0.01);。5.S、L、H、C1及C2组大鼠肺组织中IL-1β,IL-18模板mRNA水平无差异(p>0.05)。结论:1.高潮气量所导致的呼吸机相关性肺损伤,其早期发病机制可能与凋亡、脂质过氧化反应不相关。2.高潮气量可以造成肺组织内Pannexin-1活化,导致ATP释放增加,ATP经与P2X7受体结合并致其活化,增加cleaved-Caspase-1释放,继而剪切pro-IL-1β及pro-IL-18为成熟体并释放,加重肺损伤。3.应用甘珀酸预处理可以通过抑制Pannexin-1释放ATP,减少P2X7受体活化,从而减少IL-1β和IL-18释放,起到肺保护作用。