论文部分内容阅读
由新月弯孢菌(Curvularia lunata)引起的玉米弯孢叶斑病(Curvularia leaf spot)是一种常见的玉米叶部病害。该病害曾在我国流行发生,带来了极大的经济损失。弯孢菌可以产生一种非寄主选择性毒素甲基-5-(羟甲基)呋喃-2-羧酸(M5HF2C)。该毒素是弯孢菌产生的一种主要的致病因子,威胁着粮食生产,但目前对于该毒素的合成机制及调控模式的研究尚不充分。本研究从弯孢菌中成功克隆到了velvet家族clvelB基因,证明该基因可以调控弯孢菌分生孢子形成、M5HF2C毒素产生及致病性,并且影响了毒素合成相关基因clt-1的表达。为深入研究clt-1基因调控弯孢菌毒素合成机制,构建了弯孢菌cDNA文库,并筛选到与Clt-1互作的蛋白ClXyn24、ClAxe43,采用BiFC和GST Pull-down的方法分别在体内和体外证明了Clt-1可以与ClXyn24、ClAxe43发生直接的互作。采用Y2H方法证明了BTB结构域为Clt-1与ClXyn24、ClAxe43发生互作的重要区域,该区域的3个半胱氨酸对其与ClXyn24、ClAxe43的互作有重要贡献。ΔClXyn24、ΔClAxe43、ΔClXyn24&ClAxe43与ΔClt-1离体叶片致病力明显下降。在以木聚糖为唯一碳源培养条件下,各突变株M5HF2C毒素的合成能力显著下降;而当使用木糖代替木聚糖时,突变株的产毒能力得到了一定程度的恢复。同时,ΔClXyn24、ΔClAxe43、ΔClXyn24&ClAxe43与ΔClt-1在木聚糖平板上的产孢能力降低。此外,乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A的累积量在突变株体内减少。由于该毒素合成与乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A密切相关,因此推测Clt-1通过其BTB结构域与ClXyn24、ClAxe43发生互作,并作用于木聚糖降解为木糖的过程,而木糖进一步降解,为毒素的合成提供了必要的底物乙酰辅酶A及能量。比较clt-1突变株T806与野生型CX-3转录组差异表达基因发现,在T806中存在一个显著下调的聚酮合酶基因pks18,基因敲除试验证明了pks18控制M5HF2C毒素的合成。基因簇预测发现,包括pks18及其下游的13个基因聚集在弯孢菌CX-3基因组scaffold 9上,全长57.89 kb,并且在T806转录组中同时下调。由于次生代谢物合成基因通常是成簇聚集的,pks18和它下游13个基因和烟草白星病菌(Cercospora nicotianae)毒素-尾孢菌素(cercosporin)也有类似之处。因此,该基因簇很可能负责了弯孢菌的M5HF2C毒素的合成。由此提出clvelB和clt-1基因调控弯孢菌毒素合成的机制:clvelB基因影响clt-1的表达,Clt-1通过与ClXyn24、ClAxe43互作并作用于木糖代谢的上游途径,调控乙酰辅酶A的产生,从而影响M5HF2C毒素的合成。本文为研究该毒素的合成机理及调控模式奠定了基础,为设计新的弯孢菌杀菌剂提供靶标位点,对弯孢菌的防控也有积极的指导意义。