东北虎肾cDNA文库的构建及ESTs分析

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东北虎(Panthera tigris altaica)主要分布在亚洲东北部,由于受到栖息地及偷猎的威胁,使得东北虎种群数量急剧下降,面临灭绝的危险。东北虎的保护工作已经成为当今世界热点。cDNA文库存储细胞中100%的信使RNA,能够专一性的表达个体细胞或组织中编码的基因,用于合成特殊发育时期的蛋白质。因而,cDNA文库已经广泛应用在个体及发育各个时期,成为濒危物种资源保护不可或缺的技术手段。本研究通过TRIZOL法提取并得到高质量及高纯度的东北虎肾组织RNA,同时成功建立了东北虎肾组织cDNA文库并对ESTs片段进行初步分析。主要结果如下:  1.以两岁半东北虎肾组织RNA为材料,利用SMART技术通过逆转录反应(RT-PCR)将RNA反转录为1链cDNA(ss-cDNA),通过长距离链式反应(LD-PCR)合成2链cDNA(ds-cDNA),利用蛋白酶K及SfilⅠ酶切产物进行CHROMA SPIN-400柱分级纯化,得到的产物与载体λTripIEX2体外连接包装,最终于宿主细胞中扩增并进行重组率的测定,其中重组率为92.3%,进而对文库质量进行评估。  2.200个克隆被随机挑取用于PCR检测,共得到187个阳性克隆。通过生物信息学技术对测序回来的ESTs序列执行聚类与拼接处理,最终获取164条有效的序列。通过KEGG及Gene Ontology数据库对基因进行细胞组分、分子功能及生物学进程功能的分类,其所占比例分别为41.08%、23.23%及35.69%;根据KEGG分析基因相关的代谢通路,共得到15个非重复代谢通路;Interpro数据库分析基因编码蛋白质域并得到35个注释,最终筛选相关基因。
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