小麦抗锈病新种质的创制及新基因发掘

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sss03157017633
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小麦锈病是我国乃至全世界危害最大发生面积最广的小麦病害,主要有条锈病(Pst,Puccinia striiformis f.sp.tritici)、叶锈病(Pt,Puccinia triticina)和秆锈病(Pgt,Puccinia graminis f.sp.tritici)三种,一旦大流行会导致小麦大量减产,甚至颗粒无收。目前小麦锈病的防治主要依靠化学农药和种植抗病品种两种途径。化学农药在病害应急防治中发挥了重要作用,但农药的不合理使用不仅导致了生产成本提高,还带来了环境污染问题,种植抗病品种无疑为最为经济有效且绿色环保的途径。因此,自20世纪70年代开始,各国小麦育种工作者与病理学家共同努力,不断发掘新的抗性基因。但是由于锈菌生理小种的变异频繁及品种抗病基因单一导致抗病品种在短短几年内抗性的“丧失”。抗病新基因的发掘及鉴定是解决抗性丧失这一难题的根本途径。因此,在小麦属物种乌拉尔图小麦、栽培一粒小麦、四倍体小麦和普通小麦中开发鉴定新的抗病基因,可扩充抗病育种基因库,增强小麦栽培品种的抗性。本研究旨在(1)利用分子细胞遗传学对合成的圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体进行鉴定;(2)四倍体小麦-栽培一粒小麦双二倍体的创制及分子细胞遗传学鉴定;(3)对四倍体硬粒小麦Stewart成株期抗条锈病基因Yr3BL进行初定位以及普通小麦Aus27284的Yr80进行精细定位;(4)对普通小麦WGH54苗期条锈病抗性基因YrWGH54进行精细定位;(5)对广谱成株期叶锈病抗性基因Lr34导入硬粒小麦抗性进行评估。取得的主要结果如下:(一)圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体的分子细胞遗传学鉴定本研究对4份圆锥小麦-乌拉尔图小麦双二倍体(AABBAuAu)的染色体组成、农艺性状及高分子量谷蛋白亚基组成进行了鉴定。结果表明,4份双二倍体的株高介于108.45~139.43 cm,分蘖数介于7.3~17.5个,穗长介于10.23~12.17 cm,小穗数介于16.26~22.06个,自交结实率介于37.77%~70.46%。利用5对寡核苷酸序列探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1、Oligo-pTa71-2、pTa-713和(AAC)5进行 FISH,鉴定出双二倍体的42条染色体。减数分裂中期Ⅰ时,42条染色体大多配对成二价体,存在少量的单价体,三价体和四价体。在成株期,4份双二倍体对目前的流行条锈菌混合生理小种(条中31、条中32、条中33、条中34和水源11-4)均表现为高抗。2份乌拉尔图小麦的1Ay亚基在对应的双二倍体中得到了表达。这些双二倍体可作为新的资源材料用于普通小麦的遗传改良。(二)四倍体小麦-栽培一粒小麦双二倍体的创制及分子细胞遗传学鉴定利用60份四倍体小麦(T.turgidum,AABB,2n=4x=28)与83份栽培一粒小麦(T.monococcum,AmAm,2n=2x=14)进行远缘杂交,获得了264个杂交组合,不通过幼胚拯救技术获得了四倍体小麦-栽培一粒小麦F1,然后对杂种F1进行秋水仙碱染色体人工加倍,获得了56份新的四倍体小麦-栽培一粒小麦双二倍体(amphiploids,AABBAmAm,2n=6x=42)。对亲本以及新创制的双二倍体主要农艺性状、HMW-GS组成进行了分析并对根尖细胞染色体数目进行了FISH鉴定。主要结果如下:杂交授粉10,810朵小花,获得1983粒种子,平均结实率18.34(0-89.29%),其中90.73%(923/1017)的种子能够自然萌发长成植株。HMW-GS组分分析表明,来自栽培一粒小麦的高分子谷蛋白亚基Glu-A1m-b、Glu-A1m-c、Glu-A1m-d和Glu-A1m-h在一些双二倍体中得到了表达。条锈病田间鉴定结果表明,56份双二倍体中,45份高抗条锈病。这些双二倍体遗传多样性丰富,可以作为“桥梁”向普通小麦转移栽培一粒小麦的优良遗传物质,具有潜在的遗传育种研究价值。(三)硬粒小麦Stewart成株期抗条锈病基因Yr3BL定位和与之关联的普通小麦Aus27284成株期抗性基因Yr80精细定位利用具有条锈病成株抗性基因的硬粒小麦Stewart与澳洲高感硬粒小麦Bansi进行杂交构建F2群体,对其中来自F2的260个F3群体进行田间表型鉴定。使用90K SNP芯片中的7718个多态性标记对F2群体进行扫描分型。QTL分析结果显示,Stewart的成株期抗性由两个QTL位点控制的,分别位于1BL和3BL上。其中1BL上的QTL是基因Lr46,另一个QTL位于3BL染色体的末端区域。2017年、2018年和2019年植物生长季节对Stewart×Bansi的F3、F5和F7 RIL在田间进行条锈病成株期抗性鉴定,同时使用分子标记检测每个RIL群体的基因型。在所有的田间表型鉴定中,均可以检测到Lr46的抗性,但是较弱的QTL Yr3BL只能在F3和F5的田间表型鉴定中检测到抗性。但是2019年的田间数据显示,整个群体的抗性水平相对于2107年和2018年要低。因此,在锈病非常严重的年份,本身抗性较弱的QTL Yr3BL抗性表现不理想。同时数据显示,Yr3BL对Lr46的抗性有加性效应。通过综合分析,最终将Yr3BL定位在中国春参考基因组3BL的610 Mb-619 Mb区间。Yr3BL与最近报道的普通小麦Aus27284定位的Yr80基因在3BL的同一个区间。Yr80被定位在物理距离为55Mb的区间。为了进一步研究Yr3BL与Yr80的相对位置,在悉尼大学提供的Yr80 F6群体上获得19个重组体,同时使用侧翼标记(KASP65624和IWA6720)对两个来自F6代Yr80基因出现分离的1500粒种子进行筛选,获得4份F7重组子。这些重组子于2019年10月在悉尼大学进行田间成株期表型鉴定,分析发现,Yr80由之前定位的5.6 Mb缩小到2.1 Mb的区间。该区间在参考基因组中国春上有15个基因,该精细定位结果证明了Yr3BL与Yr80不是同一个基因,且距离Yr80至少55Mb之外。本研究筛选到的与Yr80基因紧密连锁的分子标记可用于分子育种。(四)普通小麦WGH54苗期条锈病抗性基因Yr WGH54的精细定位WGH54在苗期和成株期均表现为高抗条锈病,表明其含有全生育期抗性基因(也叫苗期抗性基因)。为了对WGH54的条锈病抗性基因进行更深入的研究,利用WGH54为抗性亲本与澳大利亚感病品种Avocet Susceptible(AvS)进行杂交,构建F2和F3群体。对其中50个F2单株进行抗性鉴定,选择10个极抗和10个极感的F2单株送90K SNP,F2的表型抗感分离比为3:1,因此WGH54的苗期抗性基因由单显性抗性基因控制,暂命名为YrWGH54。通过对90K SNP分析,初步确定该基因位于2A染色体长臂上。利用SSR标记和KASP标记对该苗期条锈病抗性QTL进行定位分析,同时对1000粒WGH54种子进行EMS诱变,筛选到4份突变体,其中一份为大片段删除突变体。利用筛选到的大片段删除突变体结合F2、F3群体对YrWGH54进行精细定位。将该基因所在区间从58Mb缩小到0.3 Mb。在该定位区间的中国春和两个四倍体小麦(Zavitan和Kronos)中一共有5个编码抗病蛋白相关的基因,候选基因的筛选为该基因的克隆奠定了基础。本研究筛选到的与抗性基因YrWGH54紧密连锁的分子标记可以作为该基因的有效标记在育种中得以应用。(五)携带Lr34的小片段D染色体导入硬粒小麦Lr34/Yr18/Sr57/Pm38(简称Lr34)是一个广谱成株抗性基因,对小麦叶锈病、条锈病、秆锈病均有抗性,Lr34被定位在普通小麦(ABD基因组)7D染色体上,因此不易应用于硬粒小麦的遗传改良。本研究使用缺失ph1基因的Capelli突变体(ph1c)将Lr34基因导入硬粒小麦染色体7A。以Langdon 7D(7A)代换系(其中7D染色体来自中国春)与缺失ph1基因的硬粒小麦Capelli杂交,以Capelli为轮回亲本,BC1F1代使用分子标记筛选纯合ph1基因突变体且含有7D染色体的株系。对筛选到的株系进行加代,使用PCR标记和D基因组特异标记Dgas进行定量PCR对植株进行筛选,获得含有Lr34基因的植株同时Dgas与对照(纯合7D,杂合7D植株)相比大量减少的植株。利用90K SNP对含小片段的7D导入到染色体7A同时含有Lr34基因的植株进行了鉴定。将两个含有小片段7D的导入姊妹系与澳洲感病品种Bansi进行杂交,以Bansi为轮回亲本,回交两次。对7D导入系回交材料的表型鉴定发现,含有Lr34基因的植株在成株期对小麦条锈病、秆锈病、叶锈病以及白粉病均表现为中抗,这些7D染色体导入系目前正在与几个硬粒小麦进行杂交和回交,旨在改善全球硬粒小麦的抗性。
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