精喹禾灵是一种典型的芳氧苯氧丙酸酯(AOPP)类除草剂,通过抑制乙酰辅酶A羧化酶活性来杀死杂草,主要用于大豆、花生和棉花等阔叶作物田防除禾本科杂草。精喹禾灵虽为低毒除草剂,但母体及其代谢产物具有遗传毒性且会引起动物肝脏功能损伤。随着精喹禾灵的大量使用,其在环境中残留污染问题已引起人们的广泛关注。研究表明,微生物降解是环境中精喹禾灵降解的主要途径之一。然而,到目前为止,有关精喹禾灵的微生物降解主要集中在降解菌株的筛选分离、代谢途径的鉴定,而针对精喹禾灵降解菌株的降解特性、关键酶基因的克隆与表达则比较少。本论文以筛选分离到的一株精喹禾灵高效降解菌株Z-1为研究对象,克隆负责精喹禾灵起始降解的酯酶基因qfeH,并研究该酯酶的酶学特性及降解精喹禾灵的分子机制,以期为环境中精喹禾灵的微生物修复提供理论基础和技术支撑。论文主要研究结果如下:1.通过富集培养法,从某长期生产精喹禾灵农药厂的活性污泥中分离到一株精喹禾灵高效降解菌株,经16S rRNA鉴定与生理生化分析,初步将该菌株鉴定为棒状杆菌属(Corynebacterium),并将其命名为Corynebacterium sp.Z-1。菌株Z-1的最适生长温度为30℃,最适生长pH为8.0,菌株Z-1对低浓度(25 mg/L)的红霉素与罗红霉素不敏感,对氨苄青霉素、庆大霉素、青霉素、氯霉素、四环素、链霉素和卡那霉素均敏感。2.通过响应面法建立了三个因素(温度、pH、接菌量)与响应值(精喹禾灵的降解率)相互作用的模型。在所选取的三个因素中,对精喹禾灵降解影响程度大小依次为:温度>接菌量>pH。研究结果显示,菌株Z-1的最适降解pH为7.0,最适温度为37℃,最适接菌量3.5%。菌株Z-1在最适降解条件下3 h内可将20 mg/L精喹禾灵降解98.8%。通过对菌株Z-1降解底物谱测定,发现菌株Z-1可降解50mg/L的精噁唑禾草灵、炔草酯、高效氟吡甲禾灵、氰氟草酯。通过HPLC与LC-HRMS分析,发现菌株Z-1降解精喹禾灵的途径为其酯键水解生成精喹禾灵酸。3.通过测定菌株Z-1的基因组完成图,依据鉴定的代谢途径和相关文献报道,采用序列比对的方法在菌株Z-1基因组中查找可能的酯酶基因。通过异源表达成功克隆到一个催化精喹禾灵降解起始反应的基因qfeH,其编码的酯酶属于角质酶。4.以精喹禾灵为底物研究QfeH的酶学特性,发现QfeH的最适酶促反应温度和pH分别为42℃和8.0;金属离子Ni2+对酶活力有一定激活作用,可使QfeH酶活力提高20%以上,Cr3+、Cu2+对QfeH的酶活力具有较强抑制效果,抑制率高达80%以上。化学试剂甲醇、乙醇、异丙醇、EDTA(5 mmol/L)、SDS、Tween-20、Triton X-100和N-乙基马来酰亚胺均对QfeH的酶活力有一定抑制作用,其中SDS与Tween-20强烈抑制QfeH的酶活力,使QfeH的酶活力仅保留在13%左右。QfeH催化精喹禾灵的动力学表明,酶最大反应速率(Vmax)为0.08 U/mg,米氏常数(Km)为11.74μM及催化效率常数kcat/Km比值为3.83×103 M-1 s-1。