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本文以油菜蜂花粉为原料,对油菜蜂花粉多糖的提取工艺、分离纯化、结构特性进行了研究,并采用现代分子生物学技术探明了油菜蜂花粉多糖的抗肿瘤作用及其作用机制。其主要研究结果如下:
1油菜蜂花粉多糖提取、分离、纯化与结构特性油菜蜂花粉经沸水浸提、乙醇沉淀可得油菜蜂花粉多糖RPP。在单因素试验基础上,通过正交试验对油菜蜂花粉多糖的提取工艺进行研究,结果表明:温度对多糖得率的影响最大,其次为提取时间、次数,料液比的影响最小;其最优提取条件为:料液比1:4,90℃水浴条件下,浸提4次,每次浸提4h,提取率达1.45%。
RPP经DEAE-SephadexA-25纤维素柱层析可得四种多糖RPP1、RPP2、RPP3、RPP4,得率分别为5.76%、2.82%、26.8%和13.4%;经葡聚糖凝胶层析柱进一步分离纯化可知RPP1为均一多糖,RPP2、RPP3、RPP4为非均一多糖,RPP2-2、RPP3-2、RPP4-1分别为其主要组分。RPP1、RPP2-2、RPP3-2、RPP4-1中性糖含量分别为:56.9%、37.5%、36.4%、4.20%,蛋白质含量分别为:10.2%、5.65%、35.6%、31.0%;糖醛酸含量分别为:8.09%、7.25%、8.96%、1.35%。气相色谱分析表明,RPP4-1为葡聚糖,RPP1、RPP2-2、RPP3-2由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖组成,RPP2-2还含有少量木糖,各级分的摩尔比分别为:1.00:2.05:0.57:4.05;1.00:0.50:0.45:1.63:0.12;1.00:3.23:0.74:7.21。
GPC法测定RPP各级分的数均分子量分别为36137、37136、63904、57592;紫外光谱、红外光谱、NMR图谱分析推测RPP3-2为一种吡喃型糖蛋白复合物,分子中含α、β两种糖苷键;碱性β-消除反应说明在RPP3-2中存在O-糖苷键,刚果红试验说明油菜蜂花粉多糖不具有三螺旋结构。
2油菜蜂花粉多糖体内抗肿瘤活性研究(1)RPP的抑瘤效果。动物抑制性肿瘤法试验结果表明RPP对S180肿瘤细胞有较强的抑制作用,三个灌胃剂量50、100、200mg/(kg.d)的抑瘤率分别为26.89%、34.45%、51.26%,存在明显量效关系,且高剂量组抑瘤率明显高于常用抗癌药Cy(46.22%)。
(2)RPP的免疫增强作用。RPP可显著提高荷瘤鼠免疫器官重量,增强荷瘤鼠单核细胞吞噬能力、脾淋巴细胞转化能力及NK细胞的杀伤力,将荷瘤鼠DTH反应程度、抗体水平恢复至正常水平,表明RPP具有增强荷瘤鼠特异性和非特异1性免疫功能的作用。
(3)RPP对荷瘤鼠抗氧化能力的影响。小鼠接种S180肿瘤细胞后体内抗氧化能力明显下降,RPP能显著提高荷瘤鼠体内抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,降低荷瘤鼠血清LDH活性,减少脂质过氧化产物MDA含量,揭示RPP可增强荷瘤鼠机体抗氧化能力。
(4)RPP对环磷酰胺抗癌活性和毒性的影响。荷瘤鼠外周血象发生明显异常,白细胞、中性粒细胞明显增多(P<0.05,与NC相比),红细胞、血红蛋白、血小板数明显降低(P<0.01,与NC相比),灌服RPP能使外周血得到明显改善。RPP与环磷酰胺合用有一定协同作用,可使环磷酰胺抗癌活性由46.22%提高到57.55%(与高剂量RPP合用),且对环磷酰胺的毒副性有一定拮抗作用,可明显改善环磷酰胺对荷瘤鼠白细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞的极显著破坏作用,一定程度缓解环磷酰胺对荷瘤鼠胸腺、脾脏的萎缩。
(5)RPP对荷瘤鼠组织形态的影响。采用动物抑制性肿瘤法,以环磷酰胺为对照,观察RPP对荷瘤鼠肿瘤、肝、肾、脾组织形态的影响,结果表明RPP对荷瘤鼠肝、肾、脾组织无明显毒副作用,且有一定保护作用;组织形态学检测结果还表明,高剂量RPP抑瘤效果较环磷酰胺好,与环磷酰胺合用有一定协同作用,同时可缓解环磷酰胺对机体免疫器官的损害。
3RPP对荷瘤鼠脾细胞细胞因子分泌及其mRNA表达的影响双抗体夹心ELISA法检测结果表明RPP可明显促进荷瘤鼠脾细胞TNF-α、IL-2的分泌,逆转录-聚合酶链反应检测结果表明RPP可提高显著TNF-αmRNA、IL-2mRNA表达(P<0.01,与荷瘤模型组比),且在一定范围内存在较好的浓度依赖关系,说明RPP可通过提高荷瘤鼠细胞因子mRNA表达来达到抗肿瘤目的。
4油菜蜂花粉多糖体外抗肿瘤活性研究MTT法检测体外抑瘤试验结果表明RPP、RPP3-2对NB4细胞的生长有明显抑制作用,两者在所用浓度范围内均有明显的剂量效应、时间效应关系,RPP3-2的作用优于RPP;RPP、RPP3-2对体外培养脾细胞IL-2、TNF-α的分泌及淋巴细胞增殖也有明显促进作用,在所用浓度范围内RPP3-2的促进作用优于RPP。形态学观察结果表明,RPP、RPP3-2处理均能诱导NB4细胞凋亡,癌细胞凋亡指数随着浓度增加或时间延长而增加,相对而言RPP3-2诱导NB4细胞凋亡作用优于RPP,但随着浓度增加、时间延长两者差别消失。