猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的母猪繁殖障碍与呼吸困难、仔猪肺炎、生长迟缓、免疫抑制、死亡率增加等症状的高度传染性疾病,目前缺乏有效的疫苗及商品化的抗病毒药物。Nsp9具有病毒RNA依赖的RNA聚合酶活性,是病毒形成转录和复制复合体的核心组件,可作为研发抗PRRSV制剂的理想靶标。本团队前期已经从骆驼体内筛选出了抗PRRSV Nsp9的纳米抗体Nb6,并验证了胞内表达Nb6的Marc-145细胞系感染PRRSV能力下降;连接细胞穿膜肽TAT的Nb6能够有效进入PRRSV易感细胞,并抑制不同基因型PRRSV复制。然而,细胞穿膜肽穿膜的随机性,提示Nb6靶向易感细胞的入胞途径仍需改进。由于PRRSV具备严格的单核巨噬细胞趋向性,在感染时,首先在猪肺泡巨噬细胞（PAM）中复制。单核巨噬细胞高表达Fcγ受体,该类受体是介导巨噬细胞内吞作用的主要受体。基于以上背景,本研究设计并表达了融合猪Ig G Fc的嵌合抗体Nb6-p Fc,使其能靶向PRRSV易感的猪单核巨噬细胞,通过Fcγ受体介导的细胞内吞作用进入细胞发挥抗PRRSV作用。该研究首先对嵌合抗体Nb6-p Fc生物学活性、内吞入PAM的效果以及抗病毒作用进行了探索,同时构建了稳定表达Nb6-p Fc的悬浮293细胞系,为开发抗PRRS药物提供了理论基础。主要研究内容及结果如下:1.猪Fcγ链接的纳米抗体表达及活性验证通过Overlap PCR获得了Nb6-p Fc基因片段,将其插入至毕赤酵母表达载体p PICZαA中,构建p PICZαA-Nb6-p Fc重组质粒,将重组质粒线性化并电转化毕赤酵母X-33菌株,经甲醇诱导,获得了酵母培养上清中表达的Nb6-p Fc。经Protein G亲和层析纯化,得到了高纯度的Nb6-p Fc。通过还原性电泳和非还原性电泳验证,Nb6-p Fc以二聚体的形式存在;ELISA、IFA和免疫沉淀试验证明,Nb6-p Fc与原核表达的Nsp9及宿主编码的Nsp9均具有较强的结合活性,可用于后续研究工作。2.Nb6-p Fc通过FcγR介导的细胞内吞作用进入细胞将不同浓度的Nb6-p Fc与PAM细胞孵育,利用IFA、Western blot、流式细胞术检测不同时间Nb6-p Fc被PAM内吞的情况。结果表明,Nb6-p Fc首先结合到细胞膜上,随后进入细胞。PAM对Nb6-p Fc的内吞具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。经CCK8细胞活性检测试剂盒检测在Nb6-p Fc的浓度低于或等于50μM时,均未影响PAM细胞活力。3.Nb6-p Fc抗PRRSV的功能研究使用不同PRRSV毒株的感染试验来探究Nb6-p Fc的抗病毒功能。结果表明,在0.01MOI病毒感染剂量下,Nb6-p Fc能够抑制基因1型毒株GZ-11、基因2型毒株GD-HD、SD-16、JX-A1、CH-1a以及重组的r SD16/TRS2/clover毒株在PAM上的复制,且随着抗体浓度升高,抑制效果逐渐增强;同时证明Nb6-p Fc与FcγR结合,引起IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40和TNF-α等多种细胞因子m RNA水平的上调,促进了抗病毒效果;多次给药能够提高Nb6-p Fc对r SD16/TRS2/clover的抑制效率。4.稳定表达Nb6-p Fc悬浮293细胞系的构建将带有信号肽的sp-Nb6-p Fc插入至慢病毒表达质粒p Lvx-IRES-Zs-Green,利用HEK-293T细胞包装慢病毒,转导至悬浮293细胞,并验证细胞上清中表达的Nb6-p Fc能够形成二聚体,且具有较好的与Nsp9结合的生物学活性。通过流式细胞仪的分选,得到了能够稳定表达Nb6-p Fc的悬浮293细胞系。综上所述,本研究成功表达了嵌合抗体Nb6-p Fc,该抗体能够通过FcγR介导的细胞内吞作用,针对PRRSV宿主靶细胞发挥抗病毒作用,具有进一步开发为抗PRRSV治疗剂的潜力。