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与传统的药物相比,重组蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确、便于临床应用、可规模化生产的优点,因此,重组药物蛋白的生产是当今国内外药物研究的热点,其中研究的重点则是如何经济、高效的生产和应用这类蛋白。虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因动植物等几种外源蛋白表达系统用来生产重组药用蛋白,但它们均存在着一些难以弥补的缺陷。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产药用蛋白的可行性,本研究选取人血浆中重要的抗凝蛋白-人抗凝血酶（hAT）作为研究对象,构建含有hAT cDNA基因的重组腺病毒载体Ad-hAT,将Ad-hAT注入羊乳腺内,感染羊乳腺上皮细胞,使hAT的cDNA基因在羊乳腺内高效表达,从而在羊乳汁中获得具有生物功能的重组人抗凝血酶（rhAT）。对rhAT进行分离纯化后,作用于弥散性静脉内凝血（DIC）大鼠模型,对rhAT治疗DIC大鼠的疗效进行评判。通过以上试验,为重组腺病毒载体介导人源基因在动物乳腺中高效表达rhAT以及rhAT在人类DIC疾病中的应用提供理论依据和技术支持。本研究主要包括以下内容:（1）提取人胚胎肝脏组织中的总RNA,经RT-PCR,获得用于表达的hAT的cDNA基因序列。对获得的cDNA序列进行测序分析,初步确定所扩增的cDNA的正确性。（2）以pcDNA3.1（+）为基础质粒,构建重组真核表达质粒p3AT,将之转入体外培养的羊乳腺上皮细胞细胞中获得表达,进一步证实hAT的cDNA序列可用于表达rhAT;（3）以pShuttle-CMV为基础质粒,构建重组穿梭载体pShAT,细菌内同源重组法获得重组腺病毒载体质粒pAd-hAT;（4）将pAd-hAT转入HEK293细胞中,通过病毒包装获得重组hAT腺病毒载体Ad-hAT;Ad-hAT在HEK293细胞内大量扩增;（5）将Ad-hAT转入体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,进一步证实Ad-hAT可用于高效表达rhAT;（6）将Ad-hAT注入羊乳腺,感染乳腺上皮细胞,在乳汁中获得rhAT,对乳汁中rhAT进行检测;应用肝素琼脂糖凝胶6FF亲和层析法分离乳汁中的重组蛋白,获得rhAT冻干粉;（7）构建大鼠DIC动物模型,分别用人血浆提取的hAT（hpAT）和rhAT进行处理,检测DIC大鼠血浆中DIC指标,进行疗效判定;（8）对hpAT和rhAT对DIC大鼠的疗效进行比较,探索在DIC治疗中,利用rhAT取代hpAT的可行性。进行上述试验研究,取得如下研究结果:（1）通过RT-PCR法从人胚胎肝脏组织中获得了hAT的cDNA基因。经DNA测序分析,所得hAT的cDNA与Genbank中的相应序列（NM000488）一致。（2）以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hAT cDNA基因的真核表达载体p3AT以及穿梭表达载体pShAT。载体p3AT含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对hAT的表达进行实时观测;构建的pShAT质粒含有GFP报告基因,可对腺病毒载体进行实时蛋白表达观测和快速滴度测定,为下一步研究rhAT的表达奠定基础。（3）将所构建并经鉴定正确的pShAT用Pme I酶切线性化,将所获得的线性化片断直接转化处于感受态且含有Adeasy-1质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了含有hAT cDNA基因的重组腺病毒载体质粒pAd-hAT。证实细菌内同源重组能高效获得重组腺病毒载体质粒。（4）在培养的HEK293细胞中,进行了重组腺病毒Ad-hAT的包装与扩增,获得了重组腺病毒Ad-hAT。（5）质粒表达载体p3AT在体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,表达含量达到了700±90 mg/L,rhAT活性为110%～120%,证实了所PT-PCR获得的hAT cDNA可用于hAT的表达;重组腺病毒载体Ad-hAT在体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,表达含量达到了900±85 mg/L,rhAT活性为120%～130%,证实了Ad-hAT在羊乳腺上皮细胞中表达的可能性,为下一步在羊乳腺内高效表达hAT奠定了基础。（6）将Ad-hAT注入羊乳腺后,在乳汁中获得了rhAT的高效表达,21 d内共11次的检测平均表达含量达到1.58±0.21 g/L,日检测单次最高3.1 g/L,活性平均为102.5±1.44 %。应用肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化rhAT后,分离纯化后的rhAT回收率达到54.7±1.0%,纯度达到92.5±0.5%。（7）成功构建大鼠DIC动物模型。（8）用rhAT和hpAT处理DIC大鼠后,rhAT和hpAT一样（P>0.05）,均有效地缓解了大鼠DIC病情,对治疗DIC大鼠具有良好的疗效,主要表现为:血浆纤维蛋白原浓度减少和血小板增多的趋势得到有效抑制;血浆内hAT活性和凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）浓度得到相应增加;谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）浓度上升的趋势得到有效抑制。结果说明,在DIC的治疗药物选择中,rhAT具有取代hpAT的可行性。本研究利用腺病毒为载体,在羊乳腺中高效表达了具有生物活性的rhAT;应用肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化rhAT,获得了较高纯度的rhAT冻干粉;应用rhAT作用DIC大鼠模型,取得了和hpAT一样的良好的治疗效果（P>0.05）。研究结果充分说明,本试验确定的重组蛋白表达与分离纯化路线是切实可行的,该方法获得的rhAT在治疗DIC疾病方面具有和hpAT同等的疗效。这些,将促进从人血浆中提取hAT这一传统生产方式的变革,使hAT生产向高效、经济、规模化方向发展;也将进一步拓宽rhAT的应用领域,创造出更大的经济和社会效益。