论文部分内容阅读
银鲫(Allogynogeneticgiblecarp,CarassiusauratusgibelioBloch)是适合人工养殖的优质鱼类,在我国淡水养殖中占据十分重要的地位。目前,制约异育银鲫养殖业健康发展的主要寄生虫病害为粘体动物病害,其中以碘泡虫属种类的危害最为严重。本研究主要以异育银鲫“中科3号”(A+系)和高体型异育银鲫(D系)为实验对象(同池饲养条件下,后者更易感染吴李碘泡虫Myxoboluswulii),针对碘泡虫的放射孢子虫阶段、早期感染性细胞在寄主血液内的发育过程、两种不同宿主靶器官的组织病理变化以及主要组织相容性复合体MHC多态性分析这四个方面问题展开了研究。
首先,对碘泡虫的传播媒介水栖寡毛类进行了研究。从中间宿主苏氏尾鳃蚓(BranchiurasowerbyiBeddard)体内释放出的成熟放射孢子虫中,找到了属于不同组合群的两种放射孢子虫。第一种属于三突放射孢子虫组合群(Triactinomyxon),该孢子虫的主要形态特点是:具有3个极囊,孢原质内含32个生殖细胞,具有一个短的孢柄和3个尾突形成的“锚状”支架。具有一个短的孢柄,是该放射孢子虫区别于其它三突放射孢子虫种类的最突出特征,18SrDNA同源序列分析结果显示,与该放射孢子虫亲缘关系最近的放射孢子虫是TriactinomyxonspSA-2005,AntonactinomyxonspKAB-2001和SynactinomyxonspKAB-2001,它与三者之间的序列一致性分别为80.33%、81.49%和81.92%。形态学和分子学数据显示,该三突放射孢子虫为未报道过的新类型,我们将其命名为蔡甸放射孢子虫(Triactinomyxoncaidianensistype)。第二种属于雷氏放射孢子虫组合群,该孢子虫主要的形态结构是:由三个极囊、内含孢原质的孢子体和3个锚状尾突(caudalprocesses)组成,无孢柄。尾突末端轻微的上翘,放大倍数观察,近末端部的尾突表面上有许多细小的形状不规则的棘状小分叉。18SrDNA序列同源序列比对结果显示,该雷氏放射孢子虫为碘泡虫M.cultus的对应放射孢子虫阶段。
其次,利用自制的M.wulii多克隆抗体,结合激光共聚焦显微镜(confocallaserscatmingmicroscopy,CLSM)和荧光免疫检测技术,跟踪观察了M.wulii在D系异育银鲫体内的发育过程,尤其是孢子形成前期的发育细节。不仅观察了原始孢原质感染性细胞(initialsporoplasminternalcells,ISIC)在血液内发育成为泛孢子母细胞孢囊(pansporocyst)的过程,而且观察到两种三核细胞结构:一种是通过细胞核直接分裂和原生质团分割而形成的单细胞多核体(multinucleateone-cell),另外一种是通过内出芽生殖方式(endogenousbudding)形成的经典的胞内细胞(cell-in-cellcondition)结构。研究结果表明存在于感染吴李碘泡虫鱼体血液中的“UBO”确实为碘泡虫的早期营养体,证实了M.wulii在寄主鱼体内的发育先经血液增殖期,再经血液微循环到达靶器官的过程;并首次为出芽生殖方式在脊椎动物体内的存在提供了直接而有力的证据。
再次,利用本实验室已有的银鲫阿朴脂蛋白(CagApo-14)特异性抗体,同步跟踪观察了吴李碘泡虫引起两种不同宿主靶器官病理变化的过程。结果显示:D系异育银鲫更易被吴李碘泡虫感染,并且吴李碘泡虫能在靶器官肝脏组织中形成大小不一的孢囊;而A+系异育银鲫也能被吴李碘泡虫感染,但是吴李碘泡虫在A+系异育银鲫肝脏组织内的繁殖却受到抑制,无法形成巨大的孢囊;另外,在A+系异育银鲫中,吴李碘泡虫寄生的肝细胞周围阿朴脂-14蛋白的表达量增高。这些结果表明A+系在抵抗吴李碘泡虫侵害能力方面比D系更强,而且具有抗菌活性的阿朴脂蛋白-14,在宿主防御吴李碘泡虫侵袭的过程可能发挥了一定的作用。
最后,对免疫相关基因MHC(主要组织相容性复合体)基因进行了初步研究。利用RACE-PCR的方法,扩增得到了D系MHCIα基因长度分别为1.5K和1.2K的cDNA序列全长;并对吴李碘泡虫病易感品系(D系)和抗性品系(A+系)的MHCIα基因片段多态性进行比较,结果表明,不同品系异育银鲫的MHCIα基因具有丰富的多态性。并分析了不同基因型在两个品系中的出现频率;在易感品系D系中初步筛选出两个转录水平高的基因型,在抗性品系A+系中初步筛选出一个转录水平高的基因型。