糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)最常见的微血管并发症之一,是导致终末期肾病(ESRD)和DM患者死亡的主要原因。约40%的1型DM和5-20%的2型DM患者可以发生DN。目前DN的发病机制尚不清楚,亦缺乏有效的治疗手段。因此,有效地预防、治疗DN已成为医学领域中极为重要的问题。DM可由多种途径损害肾脏,并累及肾脏的所有结构,导致肾小球细胞增殖、肥大,基底膜增厚和进行性细胞外基质(ECM)堆积,最终导致弥漫性或结节性肾小球硬化。转化生长因子-β1 (TGF-β1)是一种多功能的细胞因子,在DN发病中起着非常重要的作用。包括：促使肾脏固有细胞发生增殖、肥大,增加系膜细胞(MC)合成和分泌ECM,并通过增加基质降解酶抑制物活性而减少ECM的降解等方面作用。在DM肾损害中,几乎所有已证实的分子介质和细胞内传导途径都可刺激、介导肾内TGF-β1的活化。因此,探寻通过拮抗TGF-β1治疗DN的新方法,寻找其作用更特异、有效的下游因子或环节,具有重要的临床意义。microRNAs (miRNAs)作为一类小分子非编码RNA,由于其存在的普遍性以及所参与的调控过程的复杂性,成为近年来研究的热点。已有研究显示miRNAs在DM微血管并发症发病中起重要作用。miR-192作为在肾脏特异性表达的miRNA之一,可以经由其TGF-β1介导通路参与DN的ECM蛋白蓄积进程,可能机制为：TGF-β1正调节miR-192,miR-192减量调节smad相互作用蛋白1(SIP1),导致Ⅰ型胶原(CollgenⅠ)过度表达,蛋白蓄积。SIP1的3’UTR为miR-192调控靶点,miR-192通过mRNA降解途径减少SIP1表达。TGF-β1诱导miR-192表达的机制尚待进一步探讨,有证据显示miR-192启动子存在高度保守的上游区Ets-1原癌基因结合位点,而TGF-β1也诱导调控Ets-1表达,Ets-1在肾脏发育、保持肾小球完整性及基质金属蛋白酶表达中都是必需的,由此推断,TGF-β1可能是通过Ets-1调控miR-192。大多数DN患者,一旦进入DN临床蛋白尿病期,肾脏已发生不可逆的损害,病情将呈进行性发展,因此及早发现和治疗DN具有极大的临床价值。西医在治疗DN上主要是饮食治疗、控制高血糖、调节血脂、减少蛋白尿、控制高血压等对症治疗,但迄今尚未有能完全阻断DN进展的药物。因此,发挥中医药治疗特色和优势,积极探求中医药治疗DN的有效方法,防止或延缓其发展具有重要的意义。DN属于中医的“肾消”、“水肿”、“肾劳”、“关格”等范畴。脾肾亏虚是DN的发病基础,痰湿、浊毒、瘀血等是其发展过程中的促进因素,本虚标实是DN的病机特点。DN早期(Ⅲ期)多表现阴虚或气阴两虚；DN临床期(Ⅳ期)多表现脾肾亏虚、水湿内停或夹瘀血阻络；DN终末期(V期)多表现脾肾阴阳衰败、浊毒中阻。因此,对Ⅲ～Ⅳ期DN的治疗以益气健脾、滋肾养阴兼活血通络为法。中药复方制剂肾康丸由黄芪、芡实、金樱子、水蛭、益母草等药物组成,功能益气健脾、补肾固涩,利尿消肿,活血通络,符合Ⅲ～Ⅳ期DN的病因病机,具有标本兼治之功。肾康丸作为医院制剂,在临床治疗DN患者多年,疗效确切,并获得国家自然科学基金、南方医科大学开发基金及珠江医院医疗特色院长基金资助,其组方及工艺研究已获得国家发明专利。前期临床观察和动物实验研究都表明,该药在一定程度上可以改善DN一般症状,保护肾脏,延缓DN的进展。但其治疗DN的分子水平的作用机制还不清楚,有待进一步研究。因此,本课题在前期已完成的部分大鼠实验研究基础上,通过建立链脲佐菌素(STZ)致DN大鼠模型和体外高糖刺激下培养大鼠MC,观察DN大鼠肾脏TGF-β1、Ets-1、miR-192表达情况及MC中TGF-β1、Ets-1、SIP1、CollagenⅠ、miR-192的表达情况,探讨miR-192及其TGF-β1介导通路在DN发生发展中的作用机制,同时研究肾康丸对上述途径和指标的影响,进一步探讨肾康丸改善DN的细胞分子水平的作用机制,为其临床应用提供实验依据。具体如下：第1章肾康丸对DN大鼠的肾脏保护作用目的：观察肾康丸对DN大鼠模型的治疗及肾脏保护作用,为进一步研究药物作用机制提供实验依据。方法：首先用STZ按55mg·kg-1大鼠体重一次性腹腔内注射法建立大鼠DM模型,连续喂养2周,测血糖、尿蛋白、尿量。若血糖值>16.6mmol/L、尿量>原尿量150%、尿蛋白排泄>30mg/kg/24h,则造模成功,计算成模率。大鼠造模成功后,称重,随机分为3组：模型对照组、肾康丸组、美卡素组,另设正常对照组。肾康丸组大鼠实验用量设定为1.1g·kg-1大鼠体重,肾康丸研磨后用蒸馏水配成0.22g·mL-1混悬液。美卡素片组大鼠实验用量设定为7.2mg·kg-1大鼠体重,美卡素片研磨后用蒸馏水配成2.9mg·mL-1溶液。肾康丸组和美卡素组大鼠按5mL·kg-1体重,灌服相应药液；模型对照和正常对照组大鼠灌服等容积生理盐水。每日1次,连续8w。各组大鼠自由进食饮水,实验中各组不予任何降血糖药物。治疗8周,治疗期间及治疗后观察大鼠一般状况,每2w检测一次血糖、尿糖。末次给药后计24h尿量和饮水量,然后用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,腹主动脉穿刺采血,分离血清,全自动生化分析仪检测大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血总胆固醇(TC)、血甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、用紫外分光光度法检测糖化血红蛋白(GHb)；考马斯亮兰法检测24h尿蛋白(Upro)；取大鼠肾脏,观察肾脏大小,计算肾重、相对肾重,并通过HE染色法观察大鼠肾脏组织病理变化。结果：46只大鼠用于造模,成模率78.9%(30/38),成模后病死率4.67%(2/30)。8周治疗期间,模型组大鼠血糖均维持在16.7mmol·L-1以上,尿糖+++以上；表现出多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状,肾康丸、美卡素治疗组大鼠一般情况均较模型对照有所改善；正常对照组及各治疗组大鼠体重均较治疗前增加(P<0.05或P<0.01),与模型对照组相比较,肾康丸组与美卡素组增长量显著增加(P<0.01,P<0.05)。与正常对照组比较,各组大鼠血糖、GHb、24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c均升高(P<0.01),24h尿量及饮水量增加(P<0.01)；与模型对照组比较,肾康丸、美卡素治疗均可以降低24hUpro、BUN及24h尿量及饮水量(P<0.01或P<0.05)；肾康丸治疗可以降低血糖、GHb (P<0.05)。各组中,仅肾康丸组TC、TG、LDL-c明显下降(P<0.01)。与正常对照组比较,各组大鼠HDL-c显著降低(P<0.01)。与模型对照组相比,肾康丸治疗组对HDL-c具有显著升高作用(P<0.01)。与正常对照组比较,模型组大鼠肾重及相对肾重增加(P<0.01),且出现了相当于Mogensen分期的3期左右DN病理损害。肾康丸、美卡素病理改变较模型组均有不同程度的减轻,其中肾康丸组效果更为显著。结论：肾康丸能够改善实验性DN大鼠一般状态,具有一定的调节血糖、血脂代谢的作用,能够降低实验性DN大鼠尿蛋白,抑制血清BUN及Scr,改善肾脏组织病理学改变,在一定程度上缓解肾脏病理损伤,具有治疗DN大鼠,保护大鼠肾脏的作用。第2章肾康丸对DN大鼠miR-192信号通路的影响目的：探讨DN大鼠肾脏miR-192及其TGF-β1介导通路的作用机制及肾康丸的影响。方法：取第一部分各组大鼠左肾组织,沿正中矢状面剖开,用PBS冲洗干净,除去包膜,投入10%甲醛中性缓冲液中固定,应用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法进行免疫组织化学染色,分别以兔抗大鼠TGF-β1Ets-1多克隆抗体为一抗,检测肾脏组织TGF-β1、Ets-1蛋白的表达。取第一部分各组大鼠右肾组织,PBS冲洗干净后,-70℃冻藏,20mg左右肾组织冰浴中匀浆后溶解于300-μL裂解液RL中,按试剂盒说明书提取总RNA。取1.5μg总RNA采用M-MLV转录成cDNA,采用SYBR Premix Ex TaqTM在FTC-2000型实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR,内参照采用GAPDH,检测肾脏组织TGF-β1、Ets-1和miR-192 mRNA表达。结果：正常组大鼠肾脏在肾小管上皮细胞中有少量TGF-β1蛋白表达；与正常组大鼠相比,模型组在肾小管上皮细胞和髓质的TGF-β1蛋白表达量明显增加；与模型组相比较,肾康丸、美卡素治疗可以减少TGF-β1蛋白表达,具有统计学意义(P<0.01),其中肾康丸组效果更明显。Ets-1蛋白在正常组肾小球、肾小囊、肾小管散在表达；模型组则在肾小球内、肾小囊、肾小管表达增加；肾康丸组、美卡素组肾小球、肾小囊、肾小管表达量较模型组减少(P<0.01)。与正常组比较,模型组大鼠肾脏TGF-β1、Ets-1、miR-192 mRNA表达量增加；与模型组相比较,肾康丸组与美卡素组可以降低TGF-β1、Ets-1、miR-192mRNA表达。结论：DN大鼠中TGF-β1高表达,可上调Ets-1表达,从而增加miR-192表达；’肾康丸可有效抑制miR-192及其TGF-β1介导通路的表达,从而延缓DN进展。第3章肾康丸对高糖培养的MC miR-192信号通路的影响目的：探讨肾康丸对高糖培养MC miR-192信号通路的影响方法：16只大鼠随机分为4组,正常大鼠血清组、美卡素组、肾康丸高低剂量组。大鼠灌服相应的药物7天后,分离药物血清。体外培养大鼠MC。将体外高糖培养的MC分为5组：高糖对照组、正常大鼠血清组、美卡素组及肾康丸高、低剂量组。另设正常葡萄糖组。培养24h后,酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测各组MC培养上清TGF-β1含量；采用Western blot法检测各组MC细胞中Ets-1、SIP1和CollagenⅠ蛋白表达的情况；采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法观察各组MC细胞中TGF-β1、Ets-1、miR-192、SIP1、CollagenⅠmRNA表达情况。结果：与正常葡萄糖组比较,高糖培养组MC细胞上清中TGF-β1含量增加(P<0.01),Ets-1和CollagenⅠ蛋白表达增加(P<0.01),SIPl蛋白表达降低(P<0.01)。与高糖组比较,含药血清干预后,TGF-β1含量降低(P<0.01),Ets-1和CollagenⅠ蛋白表达减少(P<0.01),SIP1蛋白表达增加(P<0.01)。其中肾康丸高剂量组效果更明显。与正常葡萄糖组比较,高糖培养组MC细胞中TGF-β1、Ets-1、miR-192和CollagenⅠmRNA基因表达上调,SIP1 mRNA基因表达下调,肾康丸和美卡素干预后可以降低高糖诱导的TGF-β1、Ets-1、miR-192、CollagenⅠmRNA基因表达,上调高糖MC中SIP1 mRNA表达。其中肾康丸高剂量组效果显著。结论：.MC中miR-192及其TGF-β1介导通路的活性增加,提示高糖可以激活该通路,进而诱导ECM蛋白的蓄积；肾康丸可以抑制高糖MC细胞中激活的miR-192及其TGF-β1介导通路,减少ECM的蓄积,延缓DN进程。全文结论：本研究通过DN大鼠模型实验研究,再次证明肾康丸具有治疗DN和保护肾脏的作用；通过观察DN大鼠及体外高糖培养MC中miR-192及其TGF-β1介导通路的表达情况及肾康丸的干预效果,提示肾康丸的作用机理可能与抑制该通路活性,减少ECM的分泌与合成,延缓肾脏纤维化有关。为肾康丸应用于DN的临床治疗,提供了较为全面、深入的分子水平作用机制的理论和实验依据。