流式细胞仪快速检测真菌孢子活性方法的建立及其在消毒过程中的应用

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饮用水中的真菌污染已成为人们关注的热点。水处理消毒过程中真菌孢子的常规计数方法为异养平板计数法(HPC)。然而,这种方法耗时耗力,还存在不能计数活的但不可培养细胞(VBNC)等问题。另外,平板法仅能表征真菌孢子的可培养性,无法表征真菌孢子内部活性变化。流式细胞仪是一种快速、简单、准确的计数方法,结合相应的荧光染料可以检测细胞活性。目前,流式细胞仪(FCM)已广泛应用到水处理过程中的细菌表征以及消毒过程中细菌生存能力评估,在真菌孢子检测方面的应用很少。本文以从地下水中分离出的曲霉(Aspergillus niger)为研究对象,利用FCM结合几种荧光染料建立了快速、简便、准确的真菌孢子定量及活性检测的方法,并将FCM应用到传统氧化剂(Cl2、NH2Cl、Cl O2)对地下水中常见丝状真菌孢子(曲霉Aspergillus niger,木霉Trichoderma harzianum,青霉Penicillium polonicum)的消毒评价中。得出以下结论:(1)建立了一种基于流式细胞仪的快速、简便、准确的真菌孢子定量方法,流式细胞仪计数真菌孢子的染色方法为:真菌孢子在495 W下超声处理5 min,然后在500μL菌液中加入10μL SYBR Green I(SG)(100×)和30 m M乙二胺四乙酸(EDTA),之后在35℃避光加热20 min。流式细胞仪计数结果与显微镜计数和平板计数结果线性相关。同时,流式细胞仪可适用于水中其他真菌孢子的定量检测,以及实际水体中的真菌孢子定量检测。(2)优化了基于流式细胞仪的快速检测真菌孢子活性方法。优化后的真菌孢子膜完整性的检测方法为:在1.5 m L离心管中加入500μL菌液、10μL SG/碘化丙锭(SG/PI)(1:50)和30 m M EDTA,之后在35℃避光加热20 min。优化后的真菌孢子酯酶活性的检测方法为:在1.5 m L离心管中加入500μL菌液、0.1 M磷酸盐缓冲溶液(PBS)、10μM羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)和50 m M EDTA,之后在35℃避光加热10 min。优化后的真菌孢子胞内ROS的检测方法为:在1.5 m L离心管中加入500μL菌液和2μg/m L二氢乙锭(DHE),之后在35℃避光加热20 min。另外,优化的真菌孢子活性检测方法也可以应用到其他真菌孢子的膜完整性检测、酯酶活性检测、胞内ROS水平检测。(3)三种消毒剂处理后,三种真菌孢子的流式细胞仪定量细胞总数并未发生变化,即在消毒过程中双链DNA几乎无损伤或者损伤很小。三种真菌孢子的膜完整性的速率常数都小于其可培养性的速率常数,表明细胞在灭活过程中先丧失可培养性再失去其膜完整性。在氯氨处理过程中,真菌孢子会先降低其可培养性,然后是酯酶活性和代谢活性降低,最后是膜完整性受到损伤。即氯氨会先渗入细胞,破坏内部酶活性,然后损伤细胞膜。在氯和二氧化氯处理过程中,真菌孢子会先降低其可培养性、增加氧化应激反应,然后是膜完整性受到损伤,最后是酯酶活性降低。相比氯氨,氯和二氧化氯会先靶向孢子细胞膜,然后降低酯酶活性。
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