肌抑素对小鼠巨噬细胞的影响及肌抑素和生长抑素免疫中效果研究

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肌肉形成及其维持是一个极其复杂的过程,受严密的机制调控,主要受激素、营养、生长因子、肌肉调节因子(MRFs)及运动的调控,这些因素相互作用形成复杂的调控网络。本研究针对该网络中的两条最重要的轴:正向调控轴GH/IGF-1和负向调控轴肌抑素,通过免疫中和手段,初步研究了调控该两条路径后对小鼠肌形成过程及生长的影响,同时还初步探索了肌抑素在对免疫细胞的调控方面的新型功能。主要研究内容和结果如下:   1.肌抑素对巨噬细胞细胞因子分泌的调控及其通路   本实验表明在高脂日粮饲喂的小鼠肌肉、脂肪和脾脏中均可检测到高水平肌抑素基因的表达,在脂肪和脾脏中同时还可以检测到高水平的巨噬细胞标志基因F4/80和CD68的表达;进一步研究发现在脾脏淋巴细胞可检测到肌抑素的表达,并且LPS可增加脾脏淋巴细胞肌抑素的表达(可达259.37%,P=0.082);而进一步研究其对免疫细胞(巨噬细胞和树突状细胞)的影响发现,肌抑素主要可促进巨噬细胞炎症因子的表达,而对树突状细胞无显著影响。肌抑素处理可显著诱导骨髓来源巨噬细胞TNFα(最高可达545.71%,P=0.0011)、IL1β(最高可达14.97倍,P=0.039)、IL6(225.48%,P=0.012)等炎症因子的表达;对巨噬细胞系RAW264.7研究表明,小干扰RNA靶标ActRIIB受体后,肌抑素诱导的TNFα的表达受到抑制(抑制了50.43%,P<0.01),预示着在RAW264.7小鼠巨噬细胞系中,肌抑素对TNFα的诱导表达是通过其ActRIIB受体;同样,小干扰RNA靶标ActRIIB受体后,肌抑素诱导的IL1β的表达也受到抑制(抑制了79.18%,P=0.01),因此肌抑素也是通过ActRIIB受体诱导IL1β的表达;进一步深入研究肌抑素诱导TNFα及IL1β表达所激活的信号通路途径表明,肌抑素可能主要通过Smad(通路抑制剂可下调TNFα达51.72%,P=0.016)和JNK通路(通路抑制剂可下调TNFα达69.24%,P=0.0023)诱导TNFα的表达,而对IL1β的诱导表达可能主要通过Smad、p38及Erk通路,各通路抑制剂可分别下调IL1β达58.21%(P<0.01)、55.64%(P=0.002)及37.8%(P<0.05)。   2.免疫中和生长抑素   本实验构建、表达及纯化GM-CSF/SS和CTB/SS重组融合蛋白,分别免疫雌性BALB/c小鼠,与pBS组相比,GM-CSF/SS可显著增加免疫小鼠的体重4.62%(P<0.05),诱导高水平的抗生长抑素抗体的产生,同时该处理组血清生长激素水平显著增加了44.54%(P<0.05),相应的肌肉IGF-1 mRNA表达水平增加了94%;而CTB/SS处理小鼠后,体重并未如预期的那样显著增加,处理组血清中除均可检测到抗生长抑素抗体之外,还可检测到高水平抗CTB抗体水平,与对照组比较CTB/SS组抗CTB抗体水平增加了28.69%(P<0.05)。结果表明GM-CSF/SS可有效诱导生长抑素抗体的产生及增加免疫小鼠体重,有望进一步应用于大型动物研究;而尽管CTB/SS同样可以诱导生长抑素抗体的产生,但可能是高水平的CTB抗体抑制了动物的生长及体重的增加。   3.肌抑素单链抗体   经过密码子优化、全基因合成成功构建了全长为759 bp的抗肌抑素单链抗体,并成功在大肠杆菌中表达,经纯化发现单链抗体可有效结合肌抑素(P<0.05),而且该单链抗体可显著促进成肌细胞增殖,高浓度(8μg/ml)的单链抗体可提高成肌细胞增殖活性达31.11%(P<0.01),而且还可以降低肌抑素诱导的成肌细胞增殖抑制达55.48%(P<0.01),显著抑制肌抑素所诱导的成肌细胞细胞周期蛋白抑制剂p21表达(降低了22.48%,P<0.05);而且单链抗体还可抑制过氧化氢所诱导的成肌细胞E3泛素连接酶atrogin-1(MAFbx)和muscle ring finger1(MuRF1)的表达,与高浓度过氧化氢组比较,单链抗体共处理组的MuRF1和MAFbx表达量分别下调了80.41%(P=0.00013)和57.94%(P=0.049);而且该单链抗体还可降低过氧化氢诱导的成熟肌纤维MuRF1的表达,显著下调了33.35%(P=0.014);最后荧光素酶报告基因结果表明,该单链抗体可显著抑制肌抑素在成肌细胞的Smad信号通路(P<0.05)。
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