背景和目的肠粘膜屏障是由包括肠上皮细胞、细胞间连接及分泌性屏障所组成的结构,在维护机体内稳态、调节免疫方面发挥重要作用。肠粘膜屏障损伤是包括炎症性肠病、乳糜泻在内的多种胃肠道疾病的重要发病机制。近些年来,一度被认为缺少器质性改变依据的功能性胃肠病,如肠易激综合征的发病机制也被认为和肠粘膜屏障受损有关。对肠粘膜屏障损伤的研究离不开内窥镜检查和肠粘膜通透性的检测。而当前常规的白光内镜对隐匿性的活动性炎症诊断欠敏感,有报道显示普通白光内镜下表现为正常的患者,约30%经病理活检提示相当部分仍残留有急性活动性炎症,而这种隐匿性的急性炎症往往是炎症性肠病患者复发的危险因素；肠粘膜通透性检测方面：目前的检测方法大体分为侵入性和非侵入性两种。前者如Ussing灌流室,需要对肠粘膜进行多块的活检,并且需要新鲜的标本,还无法广泛展开；后者一般采用口服示踪分子,检测经肠道重吸收后进入循环的含量。所采用的示踪分子需要满足三个条件：1、无毒或低毒；2、正常情况下不被吸收；3、可以在尿液中定量检测。目前多采用检测尿液中小分子糖类的方法,根据不同糖类分子的吸收特性,可以反映不同肠道节段的粘膜通透性,常规采用乳果糖／甘露醇比值代表小肠通透性,采用24小时三氯蔗糖排泄量代表结肠通透性。另外常用的示踪分子是放射性51Cr-EDTA,可以检测全肠道通透性,但因为具有一定放射性和需要临时配置的特点,相比糖分子检测使用范围较小共聚焦激光显微内镜是一种新型的消化内窥镜,可以在常规内窥镜检查的同时,提供放大500-1000倍的粘膜图像,达到与横切面病理切片近似的灰度图像。除此之外,由于其光学特性,共聚焦激光显微内镜的显影需要应用荧光素作为对比剂。在溃疡性结肠炎病人中可以观察到荧光素渗漏入结肠隐窝腔,而荧光素渗漏与炎症的病理分级密切相关。因此本研究目的在于通过共聚焦激光显微内镜结肠粘膜形态和功能两方面的特征,获取更准确的结肠粘膜损伤的诊断。方法第一部分：收集2008.06.01-2009.04.01在山东大学齐鲁医院进行随访的73名溃疡性结肠炎病人作为研究对象。所有病人自愿选择共聚焦激光显微内镜代替常规内镜检查,并且签署知情同意书。首先应用白光内镜模式下炎症分级(Baron分级)评分将所观察到的粘膜表现分为四级：0级正常肠粘膜,1级介于0级和2级之间,2级碰触肠粘膜易出血,3级肠粘膜自发性出血。其中0级和1级代表正常和慢性非活动性炎症；2级和3级代表急性活动性炎症。之后用共聚焦激光显微内镜的显微镜模式将炎症分为四级：A级隐窝大小正常,排列规则；B级,隐窝大小正常,排列紊乱；C级,隐窝排列更趋紊乱,隐窝开口扩张,可有荧光素渗出；D级,正常隐窝结构大量破坏,可有隐窝脓肿。其中A级和B级代表正常和慢性非活动性炎症；C级和D级代表急性活动性炎症。除隐窝结构之外,观察结肠隐窝腔内荧光素渗漏情况,按照有无荧光素渗漏分为两组。对共聚焦激光显微内镜下间质微血管改变分为三级：无改变,轻到中度改变和重度改变。除主观分级外,将获取的共聚焦激光显微内镜静态图像做客观定量分析,以单位图像面积内隐窝数量作为隐窝结构的客观指标,以灰度值作为荧光素渗漏的客观指标。观察部位进行靶向活检,常规送病理,由三位病理医师独立作出炎症分级诊断。所用炎症分级按照Geboes分级法,共分为6级,≤3级作为非活动性炎症,>3代表急性活动性炎症。将白光内镜下和显微内镜下各炎症活动度指标与病理诊断分别作相关性分析。第二部分：收集2009.04.01-06.30的溃疡性结肠炎患者10人,符合罗马Ⅲ诊断标准的肠易激综合征患者12人,以及健康查体或结肠息肉电切后随访的对照8人。所有病人空腹口服三联糖分子(乳果糖10克,甘露醇5克,三氯蔗糖5克)溶液,后留取24小时尿液,行气象色谱分析法检测肠粘膜通透性。以前5小时尿液中乳果糖／甘露醇比例作为小肠通透性指标,24小时三氯蔗糖排泄量作为结肠通透性指标。之后所有病人接受共聚焦激光显微内镜检查,对病人结肠每10cm观察荧光素渗漏表现,记录荧光素渗漏涉及的范围,荧光素渗漏的程度,出现荧光素渗漏与注射荧光素之间的时间。将荧光素渗漏情况与肠粘膜通透性检测结果行相关性分析。对部分患者,于荧光素注射之前在回盲部局部喷洒吖啶黄,记录单位层面上上皮细胞空隙数量,注射荧光素之后重新计数上皮细胞空隙数量,观察荧光素注射前后肠粘膜上皮空隙的数量变化。分别于荧光素渗漏和无渗漏部位行靶向活检,获取的组织予透射电镜观察,重点观察基底膜完整性,以及炎症细胞穿过基底膜的情况,分析荧光素渗漏与基底膜完整性破坏间的相关性。结果第一部分：共聚焦激光显微内镜相比白光内镜对炎症程度的判断更加精确,尤其对于白光内镜下表现正常或仅有轻度炎症的病变,共聚焦激光显微内镜对急性活动性炎症的判断更加敏感。在50个病理诊断有急性活动性炎症的患者中,白光内镜判断有19人为正常或慢性炎症；而应用共聚焦激光显微内镜观察,所有50例急性活动性炎症均被诊断为C级和D级。共聚焦激光显微内镜相比白光内镜对炎症活动度的判断更为准确(P=0.005)。在共聚焦激光显微内镜下隐窝形态改变与病理分级间存在显著相关性(Spearman rho, P<0.001)。荧光素渗漏更多见于急性活动性炎症中(P<0.001)。血管改变与炎症活动度间亦存在显著正相关,共聚焦激光显微内镜下表现为重度血管病变的患者,病理诊断均显示为急性活动性炎症。客观量化分析显示：单位共聚焦激光显微内镜图像内隐窝数量与隐窝形态分级存在显著负相关(P<0.001)；单位面积内隐窝数量与病理评分间存在明显负相关(P=0.001),而灰度分析未能支持荧光素渗漏(P=0.194)。第二部分：荧光素渗漏表现与结肠粘膜通透性检测存在显著相关性,有荧光素渗漏患者的24小时三氯蔗糖排泄率显著高于无荧光素渗漏者(total sucralose secretion:FLIL,60.64±18.07mg vs.non-FLIL,33.26±8.54mg,P=0.013)。荧光素渗漏时间依赖性不明显,有荧光素渗漏者出现的时间可短在注射荧光素钠后2分钟内出现,而无荧光素渗漏者,即使注射荧光素后20分钟亦无表现。通透性增高的程度与荧光素渗漏的范围和程度呈正相关。结肠上皮细胞空隙在荧光素注射前后无显著变化(Wilcoxon test, P=0.9)。荧光素渗漏部位粘膜透射电镜显示多见基地膜疏松、断裂和淋巴细胞穿过等表现(Contingency Coefficient, value=0.441, P=0.007),同时,基底膜异常与三氯蔗糖排泄率间存在显著相关性,有基底膜异常者三氯蔗糖排泄率高于基底膜正常者(57.66±21.24 vs.42.71±16.77, P=0.04)。结论一、共聚焦激光显微内镜可以准确判断结肠粘膜炎症活动程度；二、对于白光内镜下表现正常或非活动期的溃疡性结肠炎患者,部分仍残留有隐匿的急性活动性炎症,共聚焦激光显微内镜可以提供更准确的判断;三、隐窝结构改变、荧光素渗漏和血管改变是共聚焦激光显微内镜判断炎症活动度的良好指标；四、共聚焦激光显微内镜下荧光素渗漏可以作为粘膜通透性增高的标志；五、荧光素渗漏与粘膜通透性相关；六、荧光素渗漏的途径可能为细胞间途径,上皮细胞空隙对荧光素保持不可通透状态；七、基底膜结构异常是荧光素渗漏的重要途径。研究意义本研究提出了共聚焦激光显微内镜下结肠粘膜炎症活动度的分级标准,经检验可以准确区分正常粘膜、慢性非活动性炎症和急性活动性炎症,对临床上溃疡性结肠炎患者炎症活动度的判断提供了更敏感的指标。首次观察到共聚焦激光显微内镜下结肠隐窝腔荧光素渗漏现象,并发现与结肠通透性存在相关性,为肠道粘膜病变患者在体检测肠粘膜通透性提供了可能。将消化内镜检查从单纯形态学诊断向形态与功能结合方向推动。首次在人体上证实上皮细胞更新脱落所形成的空隙无通透性。