目的：　　 在过去的20多年里，三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)被成功的用于多种血液恶性肿瘤疾病的治疗，最近的临床试验证实，在其他实体肿瘤中，ATO也显示了很好的临床应用前景。其多种作用机制被广泛的探讨，例如刺激细胞分化、诱导细胞凋亡等，近年来越来越多的证据表明，自噬在调控肿瘤细胞存活的过程中发挥着重要作用。自噬可能扮演着双面角色，既能诱导细胞对放化疗抵抗，又能导致自噬性死亡，这可能与肿瘤细胞的类型，肿瘤发生的不同阶段，药物作用的不同信号通路密切相关。目前文献表明，ATO在诱导凋亡的同时能明显的诱导肿瘤细胞自噬的发生，然而，具体的信号机制尚不明确，值得进一步研究。　　 c-FLIP(cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-convertingenzyme inhibitory protein)主要功能是抑制死亡受体介导的细胞凋亡，通常在多种肿瘤组织中表达，在蛋白水平上主要有2种形式，包括长片段的FLIPL、短片段的FLIPs。目前大多数文献报道FLIPL在调控死亡受体介导的细胞凋亡过程中发挥主要的生物学功能，该基因通过与caspase-8竞争性结合从而阻断凋亡通路的转导。最近研究表明，ATO通过抑制NF-κB转录活性，下调FLIP表达，促进肿瘤细胞发生凋亡。然而，FLIP是否参与ATO诱导的肿瘤细胞自噬调控未见报道。　　 Cbl(Casitas B-lineage Lymphoma)家族蛋白，作为E3泛素连接酶，在调控泛素化底物蛋白的降解进而影响细胞功能方面发挥着重要作用，国内外研究证实Cbl蛋白能与多种受体/非受体酪氨酸激酶底物结合，诱导其泛素化降解，我们既往的研究显示ATO可上调Cbl-b表达，然而Cbl-b能否通过泛素化FLIPL参与ATO诱导的细胞自噬尚不清楚。　　 为深入阐述ATO诱导自噬的作用机制，本研究以慢性粒细胞白血病细胞系K562、急性T淋巴白血病细胞系Jurkat、胃癌细胞系MGC803和乳腺癌细胞系MCF-7为ATO诱导自噬模型，研究FLIPL及泛素连接酶Cbl-b在调控细胞自噬过程中的作用，进一步以胃癌细胞系MGC803为模型，通过RNA干扰技术，探讨ATO诱导肿瘤细胞自噬的信号调控机制。　　 材料与方法　　 1、采用台盼蓝拒染法或MTT法测定细胞活力。　　 2、采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞凋亡判定。　　 3、采用Westernblot检测蛋白表达。　　 4、免疫共沉降检测蛋白间的共结合。　　 5、透射电子显微镜检测自噬体形成。　　 6、采用Lipofectamine2000试剂进行稳定转染和瞬时转染。　　 7、统计学处理：每次实验重复3次，数据以Means±SD.表示，采用SPSS13.0软件进行t检验。P<0.05有统计学意义。　　 结果　　 一、ATO诱导多种肿瘤细胞发生凋亡和自噬　　 (一)ATO抑制K562、Jurkat、MGC803和MCF-7细胞增殖。ATO作用K562、Jurkat、MGC803和MCF-7细胞24小时和48小时，明显抑制上述细胞的增殖。24小时的抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)分别是4.59±1.53μM、5.92±1.39μM、49.76±8.34μM和59.33±7.90μM。　　 (二)ATO诱导K562、Jurkat、MGC803和MCF-7细胞发生凋亡和自噬。ATO作用K562和Jurkat细胞(5μM)、MGC803和MCF-7细胞(20μM)12小时和24小时，Western blot显示凋亡相关蛋白PARP发生裂解，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平升高。ATO作用K562和MGC803细胞12小时，透射电子显微镜观察到在细胞胞浆中大量的自噬体形成，直径在300-900 nm之间。　　 (三)ATO诱导细胞发生保护性自噬。在K562和MGC803细胞中，自噬抑制剂氯喹(CQ)(20μM)明显增强ATO诱导的细胞增殖抑制和凋亡。　　 二、FLIPL参与调控ATO诱导的自噬　　 (一)ATO诱导K562、Jurkat、MGC803和MCF-7细胞FLIPL水平下调。ATO作用K562、Jurkat、MGC803和MCF-7细胞从1小时到24小时，Western blot检测结果显示FLIPL水平以时间依赖方式下调。　　 (二)MGC803细胞瞬时转染FLIPL-siRNA，细胞发生凋亡和自噬。使用siRNA干扰技术，MGC803细胞转染FLIPL-siRNA48小时后，Western blot检测结果显示转染的MGC803细胞发生PARP裂解和LC3-Ⅱ水平增加。　　 (三)瞬时干涉MGC803细胞中FLIPL的表达，ATO诱导的自噬明显增强。MGC803细胞转染FLIPL-siRNA48小时后，ATO(20μM)处理24小时，Westernblot检测结果显示，与对照组相比，转染FLIPL-siRNA组LC3-Ⅱ水平进一步增加。　　 (四)透射电镜显示下调MGC803细胞FLIPL蛋白表达，ATO诱导的自噬体增多。MGC803细胞转染FLIPL-siRNA48小时后，ATO(20μM)处理12小时，透射电子显微镜证实转染FLIPL-siRNA组胞浆内自噬体的数量较对照组明显增多。　　 三、Cbl-b调控FLIPL的泛素化降解参与ATO诱导的自噬　　 (一)蛋白酶体通路参与ATO诱导的K562和MGC803细胞FLIPL降解。蛋白酶体抑制剂(PS341)(5nM)预处理K562和MGC803细胞12小时，之后ATO作用6小时，Western blot检测结果显示ATO诱导的FLIPL降解被抑制。　　 (二)ATO诱导K562和MGC803细胞FLIPL泛素化。ATO作用K562细胞3小时或MGC803细胞1小时，免疫共沉淀显示ATO上调FLIPL酪氨酸磷酸化水平，诱导FLIPL泛素化。　　 (三)ATO诱导K562和MGC803细胞上调Cbl-b蛋白表达。ATO作用K562细胞或MGC803细胞从1小时到24小时，Western blot检测结果显示ATO诱导K562和MGC803细胞以时间依赖方式上调Cbl-b。　　 (四)ATO诱导K562和MGC803细胞FLIPL与Cbl-b发生共结合。K562和MGC803细胞经蛋白酶体抑制剂PS341(5 nM)预处理12小时，之后ATO作用3小时，免疫共沉淀检测结果显示ATO诱导FLIPL与Cbl-b发生共结合。　　 (五)Cbl-b参与ATO诱导MGC803细胞FLIPL的泛素化。稳定转染Cbl-b　　 shRNA或空载体的MGC803细胞，经蛋白酶体抑制剂PS341(5nM)预处理12小时，之后ATO作用1小时、3小时，免疫共沉淀检测结果显示与对照组相比，稳定转染Cbl-b shRNA的MGC803细胞，明显抑制ATO诱导的FLIPL泛素化。　　 (六)Cbl-b参与ATO诱导MGC803细胞自噬调控。在MGC803细胞中，敲除Cbl-b，FLIPL蛋白水平增加，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ水平减少。ATO作用稳定转染Cbl-b shRNA或空载体的MGC803细胞12小时，Western blot结果显示敲除Cbl-b，明显抑制ATO诱导的自噬水平，透射电子显微镜证实稳定转染Cbl-b shRNA的MGC803细胞自噬体明显减少。　　 结论　　 1、ATO抑制K562、Jurkat、MGC803和MCF-7细胞增殖，并诱导细胞发生凋亡和保护性自噬。　　 2、FLIPL参与调控ATO诱导的K562、Jurkat、MGC803和MCF-7细胞自噬。　　 3、Cbl-b介导FLIPL的泛素化降解调控ATO诱导的细胞自噬。