论文部分内容阅读
甜椒属于非冷驯化植物,在生长发育的各个阶段都容易遭受低温伤害。低温胁迫是影响我国北方地区甜椒产量和品质的重要因素。甜椒中存在低温响应途径,可能对低温响应的分子机制不同于冷驯化植物,研究甜椒对低温胁迫的响应分子机制对于培育抗寒甜椒新品种具有重要的实际应用价值。在甜椒材料的选择上,野生甜椒的抗寒性比栽培甜椒有优势,发掘其中优势抗寒基因具有重要作用,野生甜椒提供了很好的研究材料。对于野生甜椒和栽培甜椒在低温胁迫下的生理生化指标差异进行了很多研究,而对于甜椒在低温胁迫下的分子水平上研究还需要进一步探讨研究。本研究以野生甜椒CA157、栽培甜椒CA52及由二者渐渗系CL122群体为材料,首先建立了甜椒抗寒鉴定体系,检测三种材料的生理生化指标差异。为研究甜椒抗寒的分子机理,利用基因芯片技术分析对比了抗寒甜椒和冷敏感甜椒低温胁迫下的转录组水平,根据芯片分析结果,结合差异表达基因筛选克隆了甜椒抗寒相关基因CaHsfA4a,并对CaHsfA4a在甜椒抗寒作用的分子机制进行了研究。主要研究结果如下:1、渐渗系甜椒中具有抗寒性染色体区域的鉴定:甜椒抗寒性鉴定体系是通过对比野生甜椒CA157和栽培甜椒CA52在低温胁迫下的生长表型和生理生化指标差异建立的,用这个鉴定体系对渐渗系CL122幼苗进行抗寒表型鉴定,发现在低温处理后叶片生长皱缩程度比栽培甜椒CA52轻,说明抗寒相关的基因可能存在于野生甜椒的染色体区段上。低温胁迫下,相比栽培甜椒CA52,CA157和CL122细胞膜的受损害程度较轻,低温处理10d,再恢复一周后,发现CA157和CL122的存活率明显高于CA52。在对三种甜椒材料的低温处理和再恢复的过程中,渗透系CL122植株耐低温的表型与野生甜椒CA157相近,与普通栽培甜椒CA52和其它渗透系相比抗寒性明显要高。CL122的抗寒性来源于野生甜椒具有抗寒性的染色体片段,这表明在野生甜椒染色体片段上可能含有抗寒性的关键基因。2、抗感甜椒低温胁迫下的应答基因和生物学进程分析:利用基因芯片分析了CA157、CA52和CL122幼苗在低温胁迫下的基因表达差异。低温胁迫处理3d后,在CA157和CL122中检测到125个低温应答基因,在CA52中检测到165个低温应答基因,表明这些低温应答基因的差异对于抗感甜椒的抗寒和敏感性有作用影响。生物学进程富集分析和功能聚类分析结果发现,两种抗性甜椒中存在很多在信号转导和生物合成等生物进程中上调表达的差异基因,在钙信号、激素、ROS的调控过程中,大多数相关基因会被诱导表达,保持整个稳定平衡的内环境,由此可以看出Ca2+、激素和ROS这些信号分子对植株的低温调控具有重要作用,而在冷敏感材料CA52中相关基因会下调表达,进而影响抗感甜椒整个低温应答下的生物学进程,存在着差异性,使得CA157和CL122低温胁迫下抗寒性显著比CA52高。表明抗寒性基因对于低温分子机制的调控作用还是很大的。低温胁迫下,CBF（C-repeat Binding Factors）途径,磷脂生物膜调节途径,钙离子-钙调蛋白(Calciumion Calmodulin,Ca 2+Ca M)途径,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）途径,植物激素调控途径,植物能量代谢途径等7个代谢途径在抗感材料间的应答下存在着显著调整和差异。3、甜椒热激转录因子CaHsfA4a调控甜椒耐寒性的机理解析:前期筛选并克隆了响应低温胁迫表达量差异显著的甜椒小热激蛋白基因Cas Hsp22.6,研究证实Cas Hsp22.6的表达受到低温等非生物胁迫的诱导,然后通过筛选转录因子库,鉴定到一个在低温胁迫条件下表达的Cas Hsp22.6上游的热激转录因子CaHsfA4a,以甜椒A4类热激转录因子CaHsfA4a为切入点,在转录调节和蛋白互作多个层面研究CaHsfA4a基因对甜椒耐寒性的分子调节。利用q RT-PCR、Western Blot杂交的方法检测基因CaHsfA4a在低温胁迫下甜椒中的表达水平,时空特异性表达模式分析表明甜椒中CaHsfA4a的表达量与低温诱导成正相关。克隆得到的CaHsfA4a基因,对其表达模式和功能进行了分析:首先重组构建好表达载体p CAMBIA-CaHsfA4a,利用农杆菌侵染甜椒子叶节的方法转入甜椒中进行遗传转化,成功筛选获得了转基因植株。然后对转基因甜椒植株检测,结果发现目的基因已经整合到部分甜椒的基因组中,成功地获得了转基因甜椒材料。对甜椒材料进行4℃低温处理,检测转基因甜椒的耐寒相关生理指标,包括苗期低温处理及离体叶片失水率等实验,观察植株耐寒表型并统计成活率,检测到转基因植株离体叶片的相对电导率比普通植株低,生物膜稳定性要好,在4°C环境中转基因植株比普通植株的生长状态要好,可以看出转基因植株的生长受低温环境的影响要小,结果表明CaHsfA4a基因与甜椒的低温胁迫抗性相关。主要研究结果为建立了抗寒鉴定体系筛选出渐渗系体系,培育出‘中30’甜椒株系,进一步对三种甜椒进行了生理表型和转录组基因组的差异分析,筛选鉴定到Hsfs基因家族中CaHsfA4a能够与Ca Hsp22.6互作,结果表明在基因时空表达特征对比也发现CaHsfA4a在低温胁迫处理中表达量会升高,转基因甜椒抗冷性会有所提高,甜椒耐寒性的生物学功能与CaHsfA4a的低温诱导有关。