论文部分内容阅读
为了增加微卫星标记用于构建饱和的棉花分子遗传图谱，以及将功能基因组学用于棉纤维发育机理的解析和棉花遗传育种，本研究从大量的亚洲棉和陆地棉纤维发育相关EST中开发SSR引物，并且分析了SSR的特征、功能、海陆间的多态性以及在四倍体棉种At和Dt亚组的分布特征。从来源于亚洲棉开花后7～10天纤维cDNA文库的1187条EST，设计了763对EST-SSR引物，其中包含简单SSR 605条，复合SSR 158条。605条EST中，六核苷酸和三核苷酸比例最高，分别占到36％和31.3％，二核苷酸重复占20.4％，五核苷酸重复占7.9％，四核苷酸重复占4.6％。在包含简单SSR的605条EST的核苷酸重复基元中，二核苷酸重复中比例最高的是AT／TA，占12.6％。763对EST-SSR引物中687（90％）对可以在异源四倍体陆地棉TM-1和海岛棉海7124中得到扩增产物。其中有120对引物可以在这两个材料间产生多态带型，用于遗传作图。120对EST-SSR引物总共得到143个多态位点，通过作图软件，将其中的135个整合到了已有的包含511个SSR位点的遗传图谱中。从这些135个位点的分布情况来看，并不是随机的，因为有84个分布在染色体At亚组，51个在Dt亚组。利用构建的7235 5～25天的纤维和徐州142开花后0～5天的胚珠以及3～22天后纤维的cDNA文库，随机测序得到13505条EST，去掉冗余之后为5811条。其中966条包含一个以上微卫星（SSR）。根据EST-SSR引物设计的标准，共得到489对EST-SSR引物。在这部分EST中，三核苷酸重复最多，占59.1％；然后是二核苷酸重复，占30％；四核苷酸重复占6.4％；六核苷酸重复占2.7％；最少的是五核苷酸重复，占1.8％。在所有的重复基元中，AT／TA占的比例最高，约为18.4％，其余的依次为CTT／GAA（5.3％），AG／TC（5.1％），AGA／TCT（4.9％），AGT／TCA（4.5％），AAG／TTC（4.5％）等。489对引物在作图亲本TM-1和海7124间存在多态的共114对，产生130个多态位点。其中129个位点整合到现有的遗传图谱上，有66个分布在染色体At亚组，63个在Dt亚组。在从Genbank dbEST数据库下载来源于陆地棉遗传标准系TM-1的-3～3dpa胚珠的32190条EST中，去冗余之后为12463条，利用SSRIT和Primer3设计得到454对EST-SSR引物。这些EST重复基元中，六核苷酸重复和三核苷酸重复最多，分别占47.3％和38.8％，二、四、五核苷酸重复分别占7.5％、3.2％、3.2％。所有的核苷酸重复基元中，三核苷酸AGA／TCT所占比例最高，约占4.3％；二核苷酸重复中，比例最高的是AG／TC，占2.6％：四核苷酸重复中，AAAC／TTTG比例最多，占约1.5％；五核苷酸和六核苷酸重复中，CCCAA和CCACCT／GGTGGA所占比例最高，分别是0.4％和1.1％。454对引物扩增海陆BC1作图群体亲本TM-1和海7124，总共84对产生多态条带，可以进行定位研究。84对引物扩增共存在90个多态位点。其中84个位点（包括8个偏分离位点）能够整合到该作图群体的遗传框架图上。84个位点分布在26条染色体上，有40个分布在染色体At亚组，44个分布在染色体Dt亚组。616对MUSS／MUCS EST-SSR引物扩增共有22对产生多态条带。产生23个多态位点。其中有22个位点（包括3个偏分离位点）可以整合遗传框架图上。四倍体棉花基因组的At和Dt亚组各分布11个多态位点。从亚洲棉和陆地棉的87154条EST序列中，利用blastclust软件得到非冗余序列39507条，总长度为28005.9kb，其中二～六核苷酸重复大于等于18bp的SSR共有2146个，平均每13.05kb出现一个SSR。所有的重复类型中，六核苷酸重复最多，占36.8％；AT／TA比例最高，占7.4％。在本研究得到的386个标记位点中，有24对EST-SSR引物扩增得到的重复位点分布在相应的部分同源染色体上。有16对EST-SSR引物产生的重复位点分布在非部分同源染色体或同一染色体。整合后的图谱包含1052个位点，图距总计6321cM，平均两个位点间的距离为6.0cM。其中A3、A11、D1和D11染色体各包括两个连锁群。每条染色体上的标记数目从22-58不等，图距从144.5-383.5 cM。整合到遗传图谱上的43个偏分离EST-SSR标记中，偏向亲本TM-1的有22个，偏向海7124的有21个。利用Blast2go软件，将已知功能的EST按照细胞组分、分子功能和生物进程分为三大类。在细胞组分一类中，大多数被归为细胞（cell，41％）和细胞器（organelle，36％）两类；分子功能的分类中，催化活性（catalytic activity）和结合（binding）各约占22％和24％；在第三分类生物进程中，大部分归为生理进程（physiological process，38％）或细胞进程（cellular process，36％）。本研究将部分糖代谢相关基因、转录因子和信号转导类基因定位到染色体，如蔗糖合酶定位到了A6染色体上，E6定位到A5和D5染色体，MYB60定位到A13染色体等。另外，A8染色体上定位了一个耐盐蛋白基因NAU920。针对棉花遗传图谱的研究已经开发了多种分子标记，但是根据棉花已克隆的基因开发的SNP标记相对较少。利用PCR技术扩增出陆地棉TM-1和海岛棉海7124中基因FbL2A的序列，分析了材料间存在的单核苷酸多态性（SNPs）。根据TM-1和海7124两个材料中FbL2A基因的测序结果，采用NEBcutter软件分析，选择BstUI内切酶酶解扩增产物，利用Mapmaker v3.0作图软件将FbL2A基因定位到D2染色体。FIF1基因是棉纤维优势表达的一个基因，研究证明它可能在棉纤维的发育过程中起着很重要的调控作用。根据已发表的亚洲棉FIF1基因，设计特异引物，克隆了陆地棉TM-1和海岛棉海7124中FIF1基因。根据两个四倍体棉花FIF1基因的SNP变异，采用SNAP和CAPs方法将该基因定位到A8染色体。研究表明棉花SNP标记的开发是可行的，也是有效的。EST-SSR和SNP标记的开发将能够更方便的将EST或基因应用到棉花的图谱构建，QTLs定位及克隆，以及棉花二倍体和四倍体的进化与比较基因组研究。