前言生物通过生殖实现亲代与后代个体之间生命的延续。在雄性哺乳动物的生殖过程中,精子发生是个高度协调的过程。精子发生被分为三个阶段：第一阶段是生殖干细胞起始的有丝分裂过程,其通过有丝分裂转变为精原细胞最终成为精母细胞。第二阶段是精母细胞通过减数分裂转变为精子细胞,导致了单倍体圆形精子细胞的产生。第三个阶段是圆形精子细胞经过形态转变而成为精子。目前研究认为,成熟的精子不再有转录发生,因此与精子发生有关的基因在精子发生的早期阶段即开始转录。但这些转录产物并未立即翻译形成蛋白产物,而是呈抑制状态达数天,直到精子发生需要时才进行翻译。在由精原细胞转变为成熟精子的漫长过程中有很多RNA和蛋白小分子物质的参与,是一个精确和可调控的过程。本实验中所涉及的MIWI蛋白便是最近发现的一个重要的作用于该过程的小分子物质。MIWI蛋白是Argonaute蛋白家族的重要成员之一。Argonaute蛋白家族是RNA诱导沉默复合体(RISC)的核心元件,在RNA干扰(RNAi)中发挥重要作用。当小RNA与具有同源序列的靶mRNA或靶DNA结合后,Argonaute家族蛋白识别部分或者全部的核酸靶标,借以来调节mRNA的稳定性、蛋白的合成和基因组的结构。Argonaute蛋白主要包括Ago和PIWI两个亚家族。其中的PIWI亚家族主要有3个成员,分别是MIWI, MILI和MIWI2,是生殖系细胞中的特异性蛋白,与精子的发生有非常密切的关系,敲除Miwi, Mili或Miwi2基因,都会造成小鼠精子产生明显缺陷,表现为雄性不育。此亚家族与生殖细胞特异性事件相关,并且特异性分布于生殖细胞中,其表达与细胞的生长发育调节相关联。小鼠中的MIWI蛋白是这个亚家族的代表。正是由于生殖细胞表达集中的特异性,尤其是哺乳动物睾丸表达的特异性,对PIWI亚家族蛋白功能的研究主要于精子发生。目前的研究表明,在哺乳动物的生殖细胞中,PIWI亚家族蛋白通过与piRNA (piwi-interacting RNA)的结合形成piRNA复合物(piRC)来调控基因沉默途径。通过对MIWI蛋白的分析研究,有利于我们进一步了解生物配子发生的分子调控及其机理,对理解此蛋白的作用机制也有重要意义,还可以为不育症找到新的靶点,从而为临床治疗开拓思路及提供理论依据。实验材料各年龄段的SPF级C57BL／6J小鼠睾丸组织；常规免疫组化试剂盒、MIWI抗体、羊抗兔二抗、锇酸、2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、梯度酒精(70%,80%,90%,95%,100%)、二甲苯、石蜡、苏木素、中性树胶方法1、提取各年龄段小鼠睾丸组织蛋白,进行免疫印迹实验,检测是否存在MIWI蛋白的表达；2、制作小鼠睾丸组织石蜡切片,进行免疫组化实验,明确MIWI蛋白在细胞水平的表达定位；3、进一步采用免疫电镜技术,检测MIWI蛋白在亚细胞水平的表达定位。结果1.、Western结果显示了MIWI蛋白在小鼠发育的胚胎的各组织中无表达,而是存在于成年小鼠睾丸组织中,并在小鼠发育至6周、8周检测到MIWI蛋白的表达。2、免疫组化结果显示MIWI蛋白在小鼠睾丸发育的精母细胞与精子细胞时期表达。3、亚细胞定位显示MIWI蛋白存在于紧贴核膜处,表明其在核质运输中可能起到重要作用,是Chromtoid Body的重要组成成分。讨论MIWI蛋白在成熟小鼠睾丸中特异性表达。通过本实验研究,MIWI蛋白只在成年小鼠的睾丸中表达,在胚胎期以及出生后4周内小鼠的各组织中均无表达。MIWI蛋白的定位显示了生殖细胞中特异结构的存在。Chromatoid body(CB,拟染色体)是一个生殖细胞特异性的胞质结构。本实验中,电镜结果显示CB是由细丝分支形成的不规则网络,进而结合而成的紧密团块。在很多物种中,细胞中如果存在CB结构,表明该细胞为生殖细胞。目前已知有多种蛋白定位于CB中。在精子细胞中,CB以平行或是垂直的方式沿核膜快速的移动,而且有实验证明CB移动过程中从核中收集基因产物,参与核质间RNA的运输。对于CB这种生殖细胞特异结构的形成和功能的分子机制仍然需要进一步研究。本实验采用免疫电镜技术在亚细胞水平定位MIWI蛋白。本实验中采用了免疫电镜技术在精母细胞中定位MIWI蛋白的表达,可见MIWI蛋白在精母细胞后期聚合,并存在于核膜周围。免疫染色是免疫电镜技术中极为重要的一个步骤,本实验采用的是包埋前染色。免疫电镜实验过程中,即要考虑到保存较好的超微结构,又要能很好地体现免疫阳性反应。包埋前染色后的样本制作有一定的难度,但易于获得良好的免疫反应。