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白血病（leukemia）是一类造血系统的恶性肿瘤,其分型、治疗和预后均较复杂。慢性髓性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是白血病众多分型中的一种。尽管当前CML治疗的一线用药为酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）,但羟基脲（hydroxyurea,HU）这种经典的细胞周期特异性化疗药具有疗效明确、价格低廉和安全性高等优点,因而当前临床上仍常用于CML的早期控制和特殊人群（如孕期女性患者）的治疗。和许多癌症一样,耐药性的产生是白血病患者治疗过程中的重要限制因素。已有充分证据表明,microRNA（miRNA）的表达失调与多种类型白血病的发生发展以及药物敏感性调控密切相关,但迄今尚无系统性鉴定CML羟基脲化疗敏感性相关miRNA的研究。因此,鉴定未知的羟基脲化疗敏感性miRNA分子并研究其潜在的调控机制对于实现有效而价廉的CML早期治疗和控制具有重要的意义。目的本研究以人CML细胞系K562为研究对象,采用结合高通量测序筛选和生物信息学功能预测的策略,系统性鉴定与K562细胞羟基脲化疗敏感性调控相关的miRNA,并选取其中变化显著的四种代表性miRNA,研究其在K562细胞羟基脲化疗敏感性中的调控功能,并初步探讨可能的作用机制,力争为CML的耐药机制提供新的线索。方法（1）使用羟基脲处理K562细胞,构建处理前后的miRNA表达谱文库,结合高通量测序和生物信息学分析,鉴定羟基脲处理下表达水平发生显著变化的miRNA;（2）通过实时荧光定量 PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,real-timeqPCR）方法对高通量测序所筛选出的差异表达miRNA进行验证,选择经验证确定显著上调的四种代表性miRNA进行后续功能机制研究;（3）下载收集TCGA数据库中LAML患者的RNA测序数据,通过单基因GSEA（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）方法预测四种候选miRNA对白血病的可能调控机制;（4）运用Tet-on诱导型慢病毒表达系统构建可通过多西环素（Doxycycline,DOX）诱导过表达四种候选miRNA的K562稳转细胞系;（5）运用real-time qPCR方法检测羟基脲处理下K562亲本细胞系和上述四种K562稳转细胞系中四种候选miRNA的表达变化情况;（6）运用活细胞计数法检测过表达每种候选miRNA对K562细胞增殖和羟基脲化疗敏感性的影响;（7）结合碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色和流式细胞技术检测过表达每种候选miRNA对羟基脲处理下K562细胞周期的影响;（8）结合sub-G1期细胞比例分析、流式细胞术、Caspase 3活性检测和Western blot等方法,分析过表达每种候选miRNA对羟基脲处理下K562细胞凋亡的影响;（9）运用联苯胺染色法检测过表达每种候选miRNA对羟基脲处理下K562细胞红系分化的影响。（10）通过Target Scan软件预测每种候选miRNA的潜在靶标,并取四种miRNA高信度预测靶标的交集,运用real-time qPCR方法验证所选取靶标的表达是否受相应miRNA调控。结果（1）K562细胞中,若干miRNA的表达量在羟基脲处理后发生显著变化,其中miR-22,miR-27a,miR-224和miR-374a是羟基脲处理后上调最为显著的四种miRNA,上调倍数分别为3.4、3.4、2.1和3.5倍;（2）单基因GSEA分析提示miR-22/-27a可能参与白血病细胞对药物响应的调控,miR-22/-27a/-374a可能参与细胞凋亡的调控,miR-22/-224/-374a可能参与血红素代谢的调控,四种miRNA均可能参与白血病细胞周期的调控;（3）Real-time qPCR验证结果显示,使用半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）的羟基脲处理亲本K562细胞系能够成功复现四种候选miRNA在高通量测序中所表现出的显著上调;（4）Real-time qPCR验证结果显示,所构建的四种候选miRNA过表达K562稳转细胞系均可在DOX处理下成功实现相应miRNA的过表达;（5）活细胞计数显示,过表达miR-22/-27a/-224/-3 74a均可抑制K562细胞的增殖,并可通过拮抗羟基脲介导的细胞杀伤作用而降低K562细胞对羟基脲化疗的敏感性;（6）细胞周期实验显示,羟基脲本身可导致K562细胞发生S期阻滞,过表达miR-22/-27a/-224/-374a后K562细胞周期相关蛋白CDK6的mRNA水平均下降,导致K562细胞发生G0/G1期阻滞;（7）细胞凋亡方面,羟基脲处理可致使K562细胞sub-G1期细胞比例、Caspase 3活性以及凋亡标志蛋白cleaved PARP1表达水平显著上调,在此基础上过表达每种候选miRNA均可显著削弱上述各凋亡指标的上调程度;（8）联苯胺染色显示,羟基脲处理可诱导K562细胞发生红系分化,在此基础上过表达每种候选miRNA均可进一步促进羟基脲介导的红系分化;结论本研究结合高通量测序筛选和生物信息学功能预测的策略,成功鉴定到一批可能调控CML细胞羟基脲化疗敏感性的miRNA。对其中四种代表性miRNA进行实验验证发现:过表达miR-22/-27a/-224/-374a可导致K562细胞发生G0/G1期阻滞,从而帮助细胞逃逸羟基脲在S期的杀伤作用;过表达miR-22/-27a/-224/-374a可显著拮抗羟基脲介导的sub-G1期细胞增多、Caspase3活性上调和cleaved PARP1表达上调等细胞凋亡现象;过表达miR-22/-27a/-224/-374a还可促进羟基脲介导的红系分化。以上结果提示:K562细胞中,miR-22/-27a/-224/-3 74a既可拮抗羟基脲化疗所致的细胞杀伤性效应（抑制增殖、促进凋亡）,亦可促进羟基脲化疗所致的非细胞杀伤性效应（诱导分化）。