缺血后处理(ischemic postconditioning，IP)是相对缺血预处理提出的一种新概念。它是指在缺血后、永久性再灌注前对缺血组织进行多次短时间的间断性灌注。此概念是由Zhao等人于2003年在心肌缺血领域首次提出。作为一种改良的再灌注模式，缺血后处理的抗缺血-再灌注损伤作用已在某些领域的动物实验和临床研究中得到证实。由于缺血后处理在缺血后再灌注前施行，可操作性大，并且其保护效果已在部分器官中得到肯定，因而引起众多领域学者们的关注。目前对缺血后处理的研究尚属起步阶段，关于缺血后处理对脑缺血．再灌注损伤影响的研究更少，并且具体作用机制不明。现有研究认为，细胞凋亡和PI3K／Akt通路是缺血后处理作用的两大靶点，但其具体作用过程不详。 本课题拟通过局灶性脑缺血的大鼠模型，观察缺血后处理对大鼠脑缺血-再灌注损伤的影响。在此基础上，结合脑缺血-再灌注损伤的病理生理过程，进一步探讨缺血后处理抗大鼠脑缺血-再灌注损伤的机制。从而为临床治疗脑缺血-再灌注损伤提供可靠的实验依据和理论基础。课题内容分为三部分： 1缺血后处理对大鼠脑缺血-再灌注损伤的疗效观察。 2缺血后处理对大鼠脑缺血-再灌注过程中细胞凋亡的作用及其机制研究。 3 PI3K／Akt通路在缺血后处理抗大鼠脑缺血-再灌注细胞凋亡中的作用及其机制研究。 研究目的： 观察缺血后处理对大鼠脑缺血．再灌注损伤的保护作用。 研究方法： 采用开颅机械阻断大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)与控制双侧颈总动脉(bilateral common cerebral arteries，bCCA)血流相结合的方法制作实验模型。SD大鼠随机分为空白对照组(Control组)、假手术组(sham组)、缺血．再灌注组(I／R组)、缺血后处理组(IP组)，检测各组行为学、血脑屏障通透性、组织病理学、脑梗面积及半暗带区存活神经细胞的动态变化。 结果： 1行为学检测结果在再灌注14d内缺血后处理组大鼠在各时间点行为学检测结果均优于缺血-再灌注组。 2血脑屏障通透性的改变在再灌注3h时，两手术组伊文氏兰(Even’s Blue，EB)含量已显著高于假手术组(P<0.01)。两组EB含量均于再灌注24h～72h达高峰。在缺血-再灌注5d内缺血-再灌注组与缺血后处理组间始终有统计学差异(P<0.05)，并且两组血脑屏障通透性变化的规律相同。假手术组与空白对照组始终无统计学差异(p>0.05)。 3脑梗面积检测结果缺血后处理显著减小了再灌注后2d、14d的脑梗塞面积(P<0.01)。在缺血后处理组2d与14d梗塞面积无统计学差异(P=0.724)4 HE染色观察组织病理学变化手术组细胞数量减少，部分细胞表现为胞核固缩、碎裂，胞浆红染。间质组织结构疏松。其中缺血-再灌注组异常程度较缺血后处理组明显。完整细胞计数结果表明，缺血后处理组完整细胞数显著多于缺血．再灌注组(P<0.05)，但少于假手术组(P<0.05)。假手术组无明显病理改变。 5微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2，MAP-2)检测结果在缺血半暗带区，缺血后处理组MAP-2的表达量、神经细胞的极性、树突的数量在各时点均优于缺血．再灌注组，再灌注48h时MAP-2的表达较3h时变差，但仍可部分维持；而缺血-再灌注组MAP-2的表达随着再灌注时间的延长明显下降，至48h时神经细胞的极性、树突已基本消失。 结论： 缺血后处理具有显著的抗大鼠脑缺血-再灌注损伤作用。 研究目的： 观察缺血后处理对脑缺血-再灌注过程中细胞凋亡的影响，并探寻其调控细胞凋亡的作用机制。 研究方法： 模型制作同第一部分。SD大鼠被随机分为空白对照组(Control组)、假手术组(Sham组)、缺血-再灌注组(I/R组)、缺血后处理组(IP组)、缺血-再灌注组+caspase-3抑制剂组(I／R+Z-DEVD-FMK组)、缺血-再灌注组+caspase-3抑制剂溶剂组(I／R+DMSO组)。通过TUNEL染色、免疫荧光染色、Western blot及荧光分光光度计法检测细胞凋亡、细胞色素c(cytochrome c,cyt-c)释放与细胞凋亡的关系、cyt-c的释放特点及caspase-3的活性。 结果： 1 TUNEL，检测结果： 半暗带内，缺血-再灌注组及缺血后处理组TUNEL阳性细胞数较假手术组显著性升高(P<0.01)，缺血后处理组TUNEL，阳性细胞数显著低于缺血-再灌注组(P<0.01)。 2 cyt-c、TUNEL、DAPI三重染色结果： 假手术组、缺血后处理组、缺血-再灌注组均有不同数量细胞呈cyt—c／TUNEL双阳性表达，但cyt-c阳性细胞不全伴有TUNEL阳性。 3 cyt-c释放检测结果： 缺血-再灌注组cyt-c呈双峰样释放，第一高峰在再灌注3h，第二高峰在再灌注48h。缺血后处理组cyt-c释放量在再灌注3h时与缺血-再灌注组无显著差别(P>0.05)，在再灌注48ht寸较缺血-再灌注组明显降低(P<0.05)。假手术组cyt-c释放量与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)。 4 caspase-3活性检测结果： 缺血-再灌注组caspase-3的活性在再灌注3h时已开始升高，12h和24h时最高，48h时降为正常。在各相应时点，缺血后处理组caspase-3活性较缺血-再灌注组显著降低(P<0.01／0.05)，但高峰期仍在12h和24h。假手术组caspase-3活性与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)。 5 caspase-3抑制剂对cyt-c后期释放及神经细胞的影响I／R+Z-DEVD-FMK(caspase-3抑制剂)组cyt-c后期释放量显著小于I/R+DMSO组(P<0.01)，半暗带区完整细胞计数显著多于I／R+DMSO组(P<0.01)。I／R+DMSO组与I／R组比较cyt-c后期释放量、半暗带区完整细胞计数均无统计学差异(P>0.05)。 结论： 缺血后处理具有抑制本实验模型中细胞凋亡的作用。cyt-c参与了本实验模型中的细胞凋亡，并且与caspase-3之间存在着相互作用的反馈回路。缺血后处理对该反馈回路具有调节作用。 研究目的： 探讨PI3K／Akt信号通路在缺血后处理抗大鼠脑缺血-再灌注细胞凋亡中的作用及其机制。 研究方法： 模型制作同第一部分。SD大鼠被随机分为空白对照组(Control组)、假手术组(Sham组)、缺血-再灌注组(I／R组)、缺血后处理组(IP组)、缺血后处理+PI3K抑制剂组(IP+LY294002组)、缺血后处理+PI3K抑制剂溶剂组(IP+DMSO组)，通过TUNEL染色、免疫荧光染色、Western blot及荧光分光光度计法检测细胞凋亡、caspase-3活性及Akt的活性。 结果： 1 TUNEL检测结果： IP+LY294002组TUNEL阳性细胞数显著多于IP+DMSO组(P<0.05)。IP+DMSO组与IP组相比二者无统计学差异(P>0.05)。 2 caspase-3活性检测结果： 在再灌注12h、24h时，IP+LY294002组caspase-3活性均显著高于IP+DMSO组(P<0.05)，而IP+DMSO组与IP组相比无统计学差异(P>0.05)。 3体外Akt活性检测结果： 在再灌注12h、24h时，缺血后处理组Akt活性均显著高于缺血-再灌注组(P<0.05)，且随再灌注时间延长，缺血后处理组Akt活性较缺血-再灌注组稳定。 4免疫荧光染色检测磷酸化Akt底物结果： 缺血半暗带区：缺血后处理组磷酸化Akt底物阳性细胞数在再灌注12h(P<0.05)、24h(P<0.01)时均较缺血-再灌注组明显增多。随再灌注时间延长，缺血后处理组磷酸化Akt底物阳性细胞数较缺血-再灌注组稳定。 在缺血中心区：再灌注12h时，缺血后处理组和缺血-再灌注组磷酸化Akt底物阳性细胞数较假手术组已减少，至24h时两组的磷酸化Akt底物阳性细胞几乎消失。 结论： PI3K／Akt信号通路参与缺血后处理抑制凋亡、调控cyt-c／caspase-3反馈回路过程。缺血后处理有助于维持PI3K／Akt信号通路功能稳定。