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介绍： 卵巢癌在常见的女性恶性肿瘤中排第六位，占在世界范围内肿瘤致死性疾病的第15位。因为缺乏有效的生物学指标来检测，加之卵巢癌易发生早期转移，接近60％到70％的患者在确诊时就已经为临床晚期。传统卵巢癌的治疗包括手术治疗，联合化疗和放射治疗。由于化疗易产生耐药性以及就诊的患者多已经是晚期，卵巢癌的5年生存率依然只有30％。有研究发现肿瘤血管的生成在卵巢癌的进展中起到了重要的作用，近年来肿瘤血管生成日渐成为了新的研究热点。 肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)是一种多功能肽类物质，其最初是由人的肾上腺髓质分离出来的，并广泛参与人体多种生理和病理过程。多种肿瘤组织中均检测到ADM的表达，例如:乳腺癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肺癌和卵巢肿瘤。ADM参与肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡、帮助肿瘤细胞逃避免疫监视等重要过程，在肿瘤的恶性行为中起重要作用。在前期实验中已证实在上皮性卵巢癌中存在ADM过表达，且在卵巢癌的侵袭和转移中起重要作用。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的促血管生成因子之一。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是一种转录因子，HIF-1α是其氧诱导亚基，并决定其生物学活性。目前已证明HIF-1与ADM和VEGF的转录相关。在ADM基因的调节部位有至少20个HIF-1的结合位点。HIF-1是缺氧诱导基因的主要调节因子，调节VEGF。 研究发现ADM、HIF-1α、VEGF三者关系密切，但具体的关系仍未明确。并且，ADM是否参与上皮性卵巢癌血管的生成及其可能的机制目前尚未见报导。在本研究中，我们主要分析了ADM在上皮性卵巢癌血管生成中的作用，ADM、HIF-1α及VEGF在上皮性卵巢癌中的关系，以期发现ADM在卵巢癌血管生成中的作用及可能的机制。 实验方法： 1、细胞培养 人上皮性卵巢癌细胞系CAOV3在含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基上，37℃、5％ CO2条件下培养。取对数生长期的细胞，给予ADM(10 nM)或ADM抑制剂(ADM22-52)(10 nM)处理24h。 人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)购自ATCC公司。HUVECs在含10％胎牛血清、肝素钠(1mg/ml)的DMEM培养基上培养。在实验中仅选取前三代的HUVECs进行研究。 2、免疫组化 应用免疫组织化学染色法分析了56例上皮性卵巢癌组织ADM，HIF-1α和VEGF的表达和肿瘤微血管密度（microvasscular density，MVD）。MVD以CD34为指标计数。 3、质粒的构建和转染CAOV3细胞 应用RT-PCR技术由CAOV3细胞的总RNA中扩增出了ADM cDNA，并将其连入载体pcDNA3.1，命名为pcDNA3.1ADM。前期实验中已经成功构建ADMRNA干扰质粒，命名为pRNAU6.1/neo-ADMshRNA。这两种质粒均通过脂质体法转染CAOV3细胞，并构建稳定转染的细胞系。 4、Real-time PCR Real-time PCR检测转染pcDNA3.1ADM或pRNAU6.1/neo-ADMshRNA后的CAOV3 HIF-1α和VEGF mRNA的表达。检测应用ADM(10 nM)或ADM22-52(10nM)处理24h后CAOV3细胞HIF-1α和VEGF mRNA的表达。 5、Western blot 应用western blot检测转染pcDNA3.1ADM或pRNAU6.1/neo-ADMshRNA后的CAOV3细胞HIF-1α蛋白的表达。 6、MTT 应用MTT法分析ADM和ADM22-52对HUVECs增殖的影响。 7、迁移分析 应用Transwell小室模型分析ADM和ADM22-52对HUVECs迁移能力的影响。 8、体外成管分析 应用体外成管实验分析ADM和ADM22-52对HUVECs血管生成能力的影响。 实验结果： 1、在上皮性卵巢癌中ADM、HIF-1α、VEGF和CD34的表达水平相互之间呈正相关 ADM、HIF-1α和VEGF主要表达于上皮性卵巢癌细胞的胞浆和胞膜中，很少见于细胞核中。在对56例上皮性卵巢癌组织的分析中，应用积分光密度（integrated optical density，IOD）量化了免疫组化的结果。发现ADM、HIF-1α、VEGF和CD34在上皮卵巢癌的表达中存在正相关。 2、在上皮性卵巢癌中ADM的表达和MVD呈正相关 在上皮性卵巢癌中，MVD与肿瘤组织分化程度相关，而与年龄和国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期无关。在上皮性卵巢癌中，MVD和ADM、HIF-1α及VEGF的表达呈正相关。 3、ADM上调CAOV3细胞HIF-1a和VEGF的表达，ADM22-52和ADM siRNA下调CAOV3细胞HIF-1a和VEGF的表达 在CAOV3细胞中ADM基因的过表达上调HIF-1α和VEGF mRNA的表达，而干扰ADM基因则下调HIF-1α和VEGF mRNA的表达。在CAOV3细胞中ADM基因的过表达上调HIF-1α蛋白的表达，而干扰ADM基因则下调HIF-1α蛋白的表达。以ADM(10 nM)处理CAOV3细胞24h，HIF-1α和VEGF mRNA的表达升高;以ADM22-52(10 nM)处理CAOV3细胞24h， HIF-1α和VEGFmRNA的表达降低。 4、ADM促进HUVECs增殖、迁移和离体成管 ADM以时间依赖的方式促进HUVECs增殖。ADM22-52抑制HUVECs增殖也表现出时间依赖趋势。以ADM(10 nM)处理HUVECs细胞24h增加HUVECs穿过transwell膜的数量，相反以ADM22-52（10nM）处理HUVECs细胞24h减少HUVECs穿过transwell膜的数量。以ADM(10 nM)处理HUVECs细胞24h增加HUVECs形成血管网状结构的数量，以ADM22-52(10 nM)处理HUVECs细胞24h减少HUVECs形成血管网状结构的数量。 结论： 上皮性卵巢癌中ADM通过上调HIF-1α/VEGF促进血管生成，ADM在HIF-1α/VEGF的上游。ADM/HIF-1α/VEGF信号转导通路可能成为治疗上皮性卵巢癌的新的靶点。