论文部分内容阅读
杆状病毒是一类具有高度特异性宿主要求的节肢动物病毒。随着科学研究的日趋深入,杆状病毒在外源基因的表达、基因治疗载体以及新型杀虫剂等方面都取得重要研究进展。目前杆状病毒研究最为透彻的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autogarpha californica nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)。通过基因缺失研究,杆状病毒许多基因的基本功能已探明,但仍有部分基因的功能未明,特别是一些编码蛋白分子量小于100氨基酸残基的小开放读码框(Small open reading frame,s ORF),本研究选取了Bm NPV中Bm Orf98a、Bm Orf99两个未知功能的基因为研究对象,运用Red重组系统对Bm Orf98a和Bm Orf99分别进行了敲除,通过比较敲除型重组病毒和野生型病毒在病毒形态发生、病毒增殖复制等方面的差异,基本明确了Bm Orf98a和Bm Orf99基因的功能,进一步丰富了Bm NPV的分子生物学研究内容;另外,我们新预测到了一个s ORF,该s ORF与Bm NPV P74基因重叠,并通过实验证明新预测的s ORF能编码蛋白,为Bm NPV基因家族提供了新的成员:1、Bm Orf98a基因功能的研究Bm Orf98a基因位于Bm NPV基因组94474-94647nt之间,ORF全长174bp,编码57个氨基酸,预计分子量为6702Da。同源搜寻结果显示,在Gen Bank已登录的杆状病毒全基因组序列中有Bm NPV、Ac MNPV以及野桑蚕(Bombyx mandarina)NPV具有编码Bm Orf98a的同源基因,不同Bm NPV间Bm Orf98a氨基酸序列的一致性达98-100%,Bm NPV与Ac MNPV间的同源性达91%。转录时相分析结果显示,Bm Orf98a是一个晚期基因;通过Red重组系统构建敲除型病毒Bm NPV-Bm Orf98a KO-polh-GFP,修复型病毒Bm NPV-Bm Orf98a REpolh-GFP和野生型病毒Bm NPV-Bm Orf98a WT-polh-GFP,并将敲除型病毒Bm NPV-Bm Orf98a KO-polh-GFP和野生型病毒Bm NPV-Bm Orf98a WT-polh-GFP DNA分别转染Bm N细胞。结果显示,敲除Bm Orf98a病毒仍能够增殖复制,病毒DNA转染后6-24h,敲除型病毒转染细胞培养上清BV水平与对照病毒Bm NPV-Bm Orf98a WT-polh-GFP无明显差别;转染72h后,前者细胞培养上清BV水平减低略低于对照病毒转染细胞;但转染后72h,二者之间培养细胞上清的TCID50无明显差别;而病毒DNA的复制水平敲除型病毒和对照病毒Bm NPVBm Orf98a WT-polh-GFP间无明显差异。透射电镜观察显示,Bm Orf98a敲除对病毒粒子装配和多角体形成无明显影响。敲除型病毒感染72 h后,与Bm Orf98a基因3’-端部分重叠但位于病毒DNA另一条链上的Bm Orf99在培养细胞中的表达水平比对照组提高2.61倍。这些结果表明,Bm Orf98a为病毒复制非必须,缺失对病毒DNA复制、BV水平、病毒形态发生无明显影响,但可以上调与其重叠基因Bm Orf99基因的表达水平。2、Bm Orf99基因功能的研究Bm Orf99基因位于Bm NPV基因组94540-94725nt之间,ORF为186bp,编码61个氨基酸,理论分子量为7100 Da。同源搜寻结果显示,在登录的杆状病毒全基因组序列中,仅有8种杆状病毒含有Bm Orf99的同源基因;同源性比对分析发现,Bm NPV Orf99与野桑蚕NPV、灰色尺蠖蛾NPV、苜蓿银纹夜蛾核NPV的相应蛋白有较高的同源性,与其他杆状病毒的蛋白几乎无同源性,基于氨基酸序列的进化分析结果显示,Bm Orf99和中国野桑蚕NPV的类Ac122蛋白亲缘关系最接近。暗示该基因并不是核型多角体病毒中的功能性保守基因,并不是不可或缺的。转录时相分析表明Bm Orf99是一个早期基因。通过Red重组系统构建敲除型病毒Bm NPV-Bm Orf99KO-polh-GFP,修复型病毒Bm NPV-Bm Orf99RE-polh-GFP和野生型病毒Bm NPV-Bm Orf99WT-polh-GFP。并将敲除型病毒Bm NPVBm Orf99KO-polh-GFP和野生型病毒Bm NPV-Bm Orf99WT-polh-GFP DNA分别转染Bm N细胞。转染结果显示,敲除Bm Orf99病毒仍能增殖复制,透射电镜观察显示,Bm Orf99敲除对病毒粒子装配和多角体形成无明显影响。病毒DNA转染后24-72h,敲除型病毒转染细胞培养上清BV水平略高于对照病毒Bm NPVBm Orf99WT-polh-GFP;转染后72h,前者细胞培养上清TCID50略高于后者;转染6-72 h,敲除型病毒转染细胞中病毒DNA水平高于对照病毒转染细胞;敲除型病毒感染72 h后,细胞中Bm Orf98a表达水平比对照组提高2.21倍。这些结果表明,Bm Orf99为病毒复制非必须,缺失可促进病毒DNA复制,略增加BV水平,但对病毒形态发生无影响,Bm Orf99有可能通过调节病毒其他基因的表达而发挥作用。3、与P74基因重叠的s ORF的确认在Bm NPV P74基因中,经预测可能存在一个编码37个氨基酸残基的s ORF(110245nt-110355nt)(Bmp74s ORF),将其DNA序列克隆进原核表达载体p Easy,转化大肠杆菌Transetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示,Bm Orf P74s ORF获得了表达;利用重组蛋白免疫小鼠,制备了抗Bm P74 s ORF多抗。细胞免疫荧光结果显示,Bmp74 s ORF确为一小肽编码基因,表达产物主要定位在Bm N细胞的细胞核中。转录时相进行分析结果表明Bmp74s ORF为早期基因。