益生发酵乳杆菌发酵条件优化及其防治植物真菌病害作用研究

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植物真菌病害是危害农作物产量的重要因素之一,传统的化学农药防治具有较好效果,但其大量使用对食品安全、生态环境及人类社会造成了巨大压力。乳酸菌是一种人体益生菌,在代谢过程中可产生许多抑菌物质,主要包括抑菌活性蛋白、有机酸、过氧化氢、CO2等;其中抑菌活性蛋白结构较复杂,是一种具有活性的多肽或蛋白质,具有作用高效、专一、无毒、无抗药性、性质稳定等优点。长期以来,乳酸菌广泛应用于食品、保健及医疗等领域,但在植物真菌病害防治方面的研究较少,具有非常大的潜力。本文以益生发酵乳杆菌CGMCC8735为研究对象,通过培养基优化及发酵动力学研究,提高发酵乳杆菌对真菌抑菌效果。  本论文通过发酵乳杆菌CGMCC8735对植物真菌病害菌的抑菌谱研究,发现其对棉花黄萎病具有明显抑制作用,初始抑菌直径达22.20mm;对水稻纹枯病、番茄灰霉病及油菜菌核病抑制效果不明显;对白叶立枯病无抑制效果。发酵乳杆菌CGMCC8735起主要抑菌作用的物质为发酵过程中代谢产物,结果表明为活性蛋白。用抑菌圈直径表征该活性蛋白量,发酵上清液在32h内稳定,精密度相对标准偏差RSD(n=8)=3.3%,重复性及可参照性较好。  对发酵乳杆菌发酵培养基及培养条件进行优化。首先进行单因素实验,在单因素实验基础上,进行Plackett-Burman实验及爬坡实验,此后根据CCD设计原理,对培养基进行响应面分析实验。通过以上实验,获得抑菌圈直径对编码自变量的二次多项回归方程:抑菌圈直径(mm)=-1.75485+0.21918A+0.31214B+6.31464C+1.04632×10-3AB+0.039079 AC+0.11114 BC-5.94561 A2-0.011729B2-5.72979 C2,利用软件Design-Expert对方程求解得到相应培养基值:蔗糖23.07 g/L、酵母膏18.74 g/L、KCl0.85 g/L,此时抑菌圈直径达36.99mm。对优化结果验证,平均抑菌圈直径为36.78mm,与理论预测值吻合程度良好。最终确定最适发酵培养基配方:蔗糖23.07 g/L、酵母膏18.74 g/L、KCl0.85 g/L、柠檬酸氢二钠2 g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L。在最优培养基的基础上,对发酵培养条件进行单因素实验,确定最佳摇瓶发酵条件:最适装液量80/250 mL,最适接种量4%,最适初始pH值6.0,最适温度36℃,最适转速140r/min;对优化结果进行验证,抑菌圈直径达38.24mm,较初始抑菌直径增大72.25%。  在发酵优化基础上,研究发酵乳杆菌产抑菌活性蛋白的发酵动力学。选择Logistic模型来描述发酵乳杆菌生长曲线,利用Leudeking-Piret方程描述活性蛋白合成动力学过程,发现该发酵乳杆菌产抑菌活性蛋白的发酵类型属于部分生长偶联型;最后使用Leudeking-Piret-Like方程描述底物消耗的动力学规律。结果表明这3个动力学模型能较好的解释发酵实验结果,计算各个动力学模型相应参数,并对建立的三种动力学模型在3L发酵罐中进行了适用性验证,结果证明模型能较好的适用于发酵乳杆菌发酵放大过程。
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