酪氨酸酶是黑素细胞产生黑色素的关键限速酶，负责动物毛发与人体皮肤的颜色。研究表明，酪氨酸酶活性的过度表达会引起以黑色素过度积累为代表的一系列皮肤症状，酪氨酸酶抑制剂的开发一直以来作为抑制黑色素过度沉着的有效策略，成为研究者和药学工作者关注的重点。基于传统中药活性成分的安全性和有效性，本研究旨在设计、合成和筛选出更高活性、更加安全的酪氨酸酶抑制剂。
　　本课题对70种中药成分进行计算机辅助筛选，确定了包括苯丙酸类成分和酚酸类成分等6个先导化合物，利用“孪药”策略合成了14个目标化合物，利用蘑菇酪氨酸酶对目标化合物进行活性筛选，对筛出较优活性化合物进行酶动力学及相关细胞实验。主要研究结果如下：
　　1.先导化合物筛选：结合计算机辅助筛选，从70种活性成分中成功对接得到68种化合物。以对接分数作为评价依据，对其进行分类归纳；结合天然化合物的骨架优势确定出阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸和小极性酚酸类成分丁香酚、丹皮酚及其衍生物2，4-二羟基苯乙酮6个先导化合物。
　　2.肉桂酸酯类衍生物的设计与合成：基于“孪药策略”，根据天然化合物的苯丙烯酸和酚类化合物结构骨架，利用连接臂碳链长短的不同设计出60个孪药化合物并进行分子对接，最终确定以3-溴-1-丙醇为连接臂，合成14种新型肉桂酸酯类目标化合物。
　　3.蘑菇酪氨酸酶活性筛选与酶动力学研究：蘑菇酪氨酸酶活性抑制实验表明抑制剂浓度在1mM时，目标化合物中除化合物2、3、7、9和12外，其它化合物对蘑菇酪氨酸酶的抑制活性明显强于母体化合物，抑制率普遍超过60%，其中化合物8、13和14，抑制率均超过80%，高于阳性药曲酸(78.8%)。其中，化合物13与14的IC50值(分别是13.98μM和15.16μM)小于曲酸(30.8μM)，说明化合物8、13和14对酪氨酸酶的抑制活性强于阳性药曲酸；酶动力学研究通过Lineweaver-Burk图分析表明化合物14为非竞争性抑制剂，而化合物8和13为混合型抑制剂。
　　4.细胞实验研究：结合相关细胞实验测试目标化合物对B10F16细胞的细胞毒性、细胞中酪氨酸酶活性和黑素含量，结果表明化合物8、13和14在100μM范围内对B16F10细胞增殖无显著影响，细胞存活率高于阳性组，说明细胞毒性低于阳性药曲酸和熊果苷。而化合物11对黑色瘤细胞的增殖具有一定程度的抑制作用。细胞酪氨酸酶活性与黑素抑制试验结果表明，化合物11和14在100μM和200μM浓度时与阳性药曲酸和熊果苷相比具有较强的细胞酪氨酸酶抑制作用；化合物8和14在12.5μM-100μM浓度范围内与阳性药相比均具有较好的抗黑色素生成作用。
　　5.分子对接：分子对接结果表明化合物8和13与活性位点PDB5结合的二维图示显示酶与配体分子之间存在氢键作用和π-π相互作用，推断这两类分子间作用力是稳定酶-配体复合物结合力的主要类型。对接结果中化合物13和14结构中的酚羟基极大地促进了酶抑制剂的结合亲和力。此外，构效关系表明氢键是酪氨酸酶抑制剂的活性官能团。最后，在母体化合物结构基础上，继续利用含有不同酚羟基数目的活性化合物设计60种孪药化合物并进行分子对接，并以对接分数为指标进行初步评价，为寻找安全高效的酪氨酸酶抑制剂提供条件。
　　6.构效关系研究：结合活性筛选和分子对接推测酚羟基是酪氨酸酶抑制剂的必需基团，且酪氨酸酶的抑制活性与酚羟基的数目紧密相关；孪药母核上的甲氧基与乙酰基对酪胺酸酶抑制剂的抑制活性具有一定程度的阻碍作用。此外，孪药母核中引入硅烷基可增强抑制剂活性，但其细胞毒性亦随之升高。