目的:阿尔茨海默病（AD）是老年痴呆的最常见疾病,给社会和家庭带来了沉重的负担。AD是一种神经退行性疾病,其特征是神经元丢失,并伴有大脑皮层的星形细胞增生,AD与认知功能障碍和痴呆有关,不可逆转地损害大脑正常的记忆和判断力。促进神经发生是改善与AD相关的认知功能的潜在方法。蛋白质稳态的改变是AD的一个突出特征,表现为蛋白质异常聚集。因此,寻找蛋白质可能的分子靶点的研究有助于我们找到新的治疗AD的方法。水通道蛋白（AQPs）是一个形成水通道小的、整体的跨膜蛋白家族,存在于原核细胞和真核细胞的多种亚细胞膜中。AQP1在脉络丛上皮细胞中表达,参与脑脊液的形成和脑水稳态。AQPs被认为是神经疾病的潜在治疗方法。AQP1在包括AD和帕金森病等疾病的发病机制中起着至关重要的作用。β-淀粉样蛋白（Aβ）的形成是AD的起始因素,有研究证明Aβ能够诱导Wnt信号通路。因此,我们推测Wnt信号通路在AD中起着至关重要的作用。此外,越来越多的证据支持Wnt信号通路在AD治疗中的关键作用。我们推测AQP1的改变可以通过Wnt信号通路影响AD的认知功能。本实验揭示了AQP1的改变通过激活Wnt信号通路在AD发病机制中的重要作用,以期为疾病治疗提供一个新的靶点。研究方法:1、生物信息学筛选阿尔茨海默病差异基因从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库下载阿尔茨海默病基因芯片（GSE28146和GSE18309）的表达矩阵和ID注释文件。运用R语言affy包对基因表达数据进行背景校正、标准化预处理,limma包被用于差异基因筛选,绘制差异基因表达热图。运用jvenn比较2个芯片的差异基因。在DiGSeE疾病基因对阿尔茨海默病疾病相关基因进行检索。基于String数据库提供的蛋白互作信息,运用Cytoscape 3.6.0软件提取阿尔茨海默病差异基因和疾病基因的相互作用信息,并构建protein-protein interaction（PPI）网络。2、建立AD小鼠模型健康成年雄性NIH小鼠80只（9周龄）、体重18-22g,购买自广东省实验动物中心。其中10只用于对照,70只采用CA1区注射Aβ_1-42溶液（2u L,2g/L）用来构建AD动物模型,以生理盐水模拟注射小鼠作为对照组（Control）。小鼠均饲养在SPF条件的无菌层流柜中。实验经动物伦理委员会批准。3、慢病毒构建与动物分组慢病毒:pSIH1-H1-copGFP（sh-,干扰载体）;慢病毒:p LV-EGFP-N（oe-,过表达载体）,载体均购自于上海吉玛公司。构建基于慢病毒的AQP1干扰载体和AQP1过表达载体。在体外包装的高滴度慢病毒颗粒经AD小鼠脑立体定位术注入海马CA1区。将AD小鼠分为四组:oe-AQP1（注射oe-AQP1慢病毒）,oe-NC（注射oe-NC慢病毒）,sh-AQP1（注射sh-AQP1慢病毒）,sh-NC（注射sh-NC慢病毒）。对小鼠进行慢病毒注射后2周,对转染小鼠进行后续实验。4、避暗实验本实验为小鼠行为学实验,实验于手术后11～12 d进行。首次实验前,让小鼠在试验箱中适应3 min。将小鼠背向洞口放入明室,小鼠通过洞口进入暗室受到电击后取出,24 h后重做测试,记录小鼠300 s内首次遭到电击时间即潜伏期,遭受电击次数即错误次数。5、水迷宫实验（1）定位航行实验:所有小鼠进行隐藏平台实验,共5天,每天定时上下午训练4次,将各小鼠从四个象限,面向池壁放入水中,记录下小鼠在1min内寻找到平台所需的时间（逃避潜伏期）。（2）空间探索实验:第6天撤掉水下平台,随机选择1个象限将小鼠面向水池壁放入水,记录下小鼠1min内进入原水下平台象限的次数。6、逆转录定量PCR（qRT-PCR）采用TRIzol提取海马组织和细胞的总RNA,nanodrop2000微量紫外分光光度计检测提取的总RNA浓度和纯度。按照PrimeScript RT reagent Kit说明书进行逆转录生成cDNA,设计AQP1的引物。应用ABI7500定量PCR仪进行实时荧光定量PCR检测,以GAPDH作为内参引物,采用相对定量法（2-△△Ct法）计算目的基因的相对转录水平:△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组,△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参）,目的基因mRNA的相对转录水平=2-△△Ct。7、免疫印迹（Western blot）采用含有PMSF的RIPA裂解液提取海马组织和细胞总蛋白,用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。每个样品含50μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,湿转法将蛋白转移至PVDF膜,然后将PVDF膜与稀释的一抗,GAPDH为内参,再孵育HRP标记的二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）,TBST漂洗后,取ECL荧光检测试剂盒反应后放入凝胶成像仪中曝光成像。用Bio-Rad图象分析系统照相,用软件Quantity One v4.6.2分析,以相应蛋白条带的灰度值/GAPDH蛋白条带的灰度值的结果表示相对蛋白的含量。8、HE染色实验小鼠麻醉后,用生理盐水和多聚甲醛灌注心脏,钝性分离并取出海马组织制成石蜡标本组织切片。切片经脱蜡、逐级脱水后,进行苏木素染色、盐酸乙醇分色、然后进行伊红染色、逐级脱水、透明、最后封片,于显微镜下观察。9、免疫组化切片常规脱蜡,过氧化氢孵育,蒸馏水冲洗,PBS浸泡。将切片浸入枸橼酸盐缓冲液,微波炉加热至沸腾后断电,冷却后PBS洗涤,滴加正常山羊血清封闭液,室温孵育,加入稀释的caspase-3抗体,4℃过夜,PBS冲洗,滴加生物素标记羊抗兔lgG,37℃温育后PBS冲洗。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃温育后PBS冲洗,DAB室温显色。镜下控制反应时间,苏木素复染,自来水洗涤,常规脱水、透明、封片、镜检。10、海马神经元的分离与培养1日龄胎鼠,钝性分离海马并去除血管及脑膜,将海马剪成小块,经胰蛋白酶和DNA酶作用12 min后,以马血清阻止消化,吸管多次吹打,以使细胞充分分散。在充分分散的细胞悬液中加入MEM完全培养液,过滤后将滤液加入到35mm培养皿中（培养皿中有包被多聚-L-赖氨酸盖玻片）,放于恒温培养箱内培养。培养至第3天时加入阿糖胞苷溶液,再经24h后换为完全培养液。培养至第七天的海马神经元采用SP法进行NSE免疫细胞化学染色,来鉴定海马神经元。11、细胞分组及处理待细胞培养至第7天,将培养的细胞分为以下4组:Control对照组:正常培养的海马神经元;Aβ处理组:单纯含5μmol/L寡聚态Aβ_1-42的无血清培养基处理24h;Wnt3a+Aβ处理组:预先0.5 nmol/L Wnt3a蛋白作用2 h后,更换含5μmol/L寡聚态Aβ_1-42的无血清培养基继续作用24 h;Dkk1+Aβ处理组:预先1.0μg/mL Dkk1蛋白作用2 h后,吸弃,更换含5μmol/L寡聚态Aβ_1-42的无血清培养基继续作用24 h。12、Tunel染色采用荧光标记终末脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labelling,TUNEL）,按试剂盒说明书所示的步骤进行染色,再应用DAB显色,封固,最后在显微镜下观察结果。每张切片随机选取20个高倍（×400）视野,统计细胞数,计算出海马神经元细胞的凋亡百分率。13、统计学分析方法采用SPSS 19.0版本（IBM SPSS Statistics,Chicago,IL,USA）用于统计分析。计量数据采用Mean±SD表示,正态分布的两组数据比较采用unpaired Student’s t test,多组间数据比较采用one-way ANOVA,Tukey’s进行事后检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、在AD中AQP1高度表达运用R语言从阿尔茨海默病芯片中筛选差异基因,分别从GSE28146和GSE18309芯片中筛选得到757和770个差异基因,选取两个芯片的前400个基因进行比较,我们发现有12个交集基因将这12个基因作为阿尔茨海默病差异基因进行后续分析。在DiGSeE中查询阿尔茨海默病疾病相关基因,选取前20个基因作为疾病基因。构建了阿尔茨海默病疾病基因和差异基因PPI网络。发现在该网络中与其他基因关联度最高的差异基因是AQP1。绘制GSE28146芯片前100个差异基因表达热图,我们注意到在AQP1在阿尔茨海默病患者中高表达。提取芯片GSE18309中AQP1的表达谱,AQP1在阿尔茨海默病患者中的表达明显高于对照正常者。通过qRT-PCR和Western blot检测AD小鼠海马神经元细胞的AQP1水平,我们发现AD小鼠中AQP1较对照组高表达。2、AQP1沉默改善AD小鼠的认知功能通过已成功建立AD模型小鼠海马CA1区注射慢病毒分别过表达和沉默APQ1,并设立相关对照组,2周后通过避暗实验和水迷宫实验对小鼠的认知功能进行检测,我们发现过表达AQP1的AD小鼠模型较对照组认知功能下降;沉默AQP1的AD小鼠模型较对照组认知功能明显改善。3、沉默AQP1对AD小鼠海马神经元具有保护作用通过显微镜下观察各组小鼠的HE染色海马切片和免疫组化caspase-3证实,沉默AQP1能够抑制AD小鼠神经元凋亡,维持海马神经元的正常形态,对海马神经元具有保护作用。4、AQP1抑制WNT信号通路通过Western blot检测AQP1对海马组织Wnt信号通路相关蛋白的影响,实验结果证实,在AD小鼠模型中Wnt信号通路被抑制,且沉默AQP1后能够使Wnt信号通路被激活。5、通过抑制WNT信号通路,AQP1促进神经元凋亡,从而损害AD小鼠的认知功能成功分离培养神经元后,用Aβ_1-42和Wnt通路抑制剂和激活剂对神经元进行处理,Western blot检测各组Wnt信号通路相关蛋白的影响,用Tunel检测各组神经元凋亡情况,实验结果证实:激活Wnt信号通路有利于减轻Aβ_1-42诱导的神经元凋亡。通过抑制WNT信号通路,AQP1促进神经元凋亡,从而损害AD小鼠的认知功能。结论:1、在AD中AQP1高度表达。2、AQP1沉默改善AD小鼠的认知功能。3、沉默AQP1对AD小鼠海马神经元具有保护作用。4、AQP1抑制Wnt信号通路。5、通过抑制Wnt信号通路,AQP1促进神经元凋亡,从而损害AD小鼠的认知功能。6、沉默AQP1通过激活Wnt信号通路增强了AD的认知功能,提出了一种针对AD的新靶点的潜在治疗策略。