端粒酶(Telomerase)能以自身RNA作为模板合成端粒序列,维持端粒的长度和功能,使肿瘤细胞永生化。作为一种重要的肿瘤标识物,灵敏可靠检测端粒酶活性非常重要。基于此,我们建立了简单可靠检测端粒酶活性的比色法,旨在实现便捷、低成本、目视检测端粒酶活性。本文的主要研究内容可总结为以下:一、基于DNAzyme可视化检测端粒酶活性比色法研究G 四链体 DNAzyme(G-quadruplexDNAzyme)是一种由富 G 的 DNA序列和氯化血红素(hemin)形成的一类人工酶,能够有效催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和H202溶液发生氧化,生成蓝色的TMB+,实现比色检测。将G四链体DNAzyme有效的催化能力和端粒酶延长反应的自放大能力结合,建立了一种可靠检测端粒酶活性的比色法。端粒酶底物DNA(TS)首先被固定到氨基化磁珠表面(MB)上,形成MB-TS复合物。当端粒酶和dNTPs存在时,TS的3 ’末端将被加上TTAGGG的端粒重复序列。经过磁分离反复洗涤后,在钾离子(K+)和hemin存在下,TS延长的富G端粒序列形成G四链体DNAzyme,催化无色的TMB/H202溶液发生氧化,生成蓝色的TMB+,实现端粒酶活性的比色检测。一条TS可以被端粒酶延长出多个TTAGGG的重复序列,与K+和hemin形成多个G四链体DNAzyme,实现信号放大。同时,使用磁珠可以避免细胞裂解液的影响,并富集端粒酶延长产物,进一步提高信噪比。通过裸眼观察,可以检测出20个HeLa细胞当量的端粒酶活性。通过测定紫外可见吸收光谱,能检测出10个HeLa细胞当量的端粒酶活性。在人血清中,能裸眼检测出100个HeLa细胞中的端粒酶活性。二、灵敏可视化检测端粒酶活性比色法研究基于端粒酶的自放大作用和磁珠富集,构建了一种可靠、灵敏检测端粒酶活性的比色法。醛基修饰的端粒酶底物TS通过席夫碱反应偶联到氨基化磁珠(MB)的表面。端粒酶存在时,会将TS的3’末端延长多个TTAGGG重复序列。延长的重复序列与生物素修饰的cDNA杂交,再与链霉亲和素化的辣根过氧化物酶(SA-HRP)结合。通过磁分离,将多余的cDNA和SA-HRP除去,特异性结合到MB表面的HRP可以催化TMB/H202发生氧化,使TMB/H202溶液由无色变为蓝色,实现端粒酶活性的可视化检测。通过裸眼观察,能检测出5个HeLa细胞当量的端粒酶活性。通过测定紫外可见光谱,能检测出1个HeLa细胞当量的端粒酶活性。通过裸眼观察,能测出20个HeLa细胞中的端粒酶活性,通过测定紫外可见光谱,能检测出5个HeLa细胞中的端粒酶活性。在人血清中,能可视化检测出50个HeLa细胞中的端粒酶活性,通过测定紫外可见光谱能检测出10个HeLa细胞中的端粒酶活性。三、基于光诱导电子转移灵敏实时研究限制性内切酶活性及抑制基于光诱导电子转移机理(Photo-induced electron transfer,PIET)构建了一种灵敏且能实时监测限制性内切酶活性和抑制的荧光分析法。以3’端羧基荧光素(FAM)标记的单链DNA作为信号探针,以与信号探针完全互补单链DNA5’端的三个G碱基作为信号转换元件。信号探针和其互补单链DNA通过杂交作用形成限制性内切酶的双链DNA底物,FAM因靠近G碱基发生PIET,荧光被猝灭。限制性内切酶存在时,在酶切位点对双链DNA进行特异性切割,使得FAM远离G碱基,荧光恢复。在5×10-5U/μL-1×10-2U/μL浓度范围内,荧光增强值与EcoRI浓度的对数值呈较好线性关系,检出限为4×10-5U/μL,这比很多已有的内切酶活性分析方法更灵敏。本方法可以实现限制性内切酶酶切过程的实时检测,还可以用于内切酶抑制剂的筛选。本方法为简单、灵敏、实时研究DNA/蛋白相互作用提供了新思路。