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杀菌/渗透增强蛋白(BPI)是存在于人和哺乳动物多形核中性粒细胞嗜天青颗粒中的一种阳离子抗菌蛋白。本实验室一直从事BPI及其功能片段的研究，并且通过原核和真核等表达系统获得了由BPI N端功能性片段BPI<,23>与IgGl Fc嵌和组成的BPI<,23>-Fc γ 1融合蛋白。鉴于目前市售BPI试剂盒包被抗体是针对BPI C端的特异性抗体，无法用来检测鉴定BPI N端功能片段，这给BPI<,21>或BPI<,23>-Fc γ 1重组蛋白的鉴定及其功能研究带来一定的困难。为此，本实验运用生物信息学方法，模拟设计合成BPI N端优势抗原表位肽，将其免疫动物获得相应特异性抗体，以期为BPI N端蛋白的检测鉴定、功能研究和临床应用奠定基础。此外，根据上述抗原表位肽氨基酸种类和组成预测，本实验选用的抗原表位肽有可能具有中和内毒素等生物学活性作用。因此，对上述合成的抗原表位肽进行了体内外生物学活性研究，以期为临床内外源性内毒素血症的治疗，提供一种新的抗感染生物制剂。本课题研究工作分为以下两部分：
第一部分：BPI N端优势抗原表位肽的模拟合成及其抗血清的制备
1．抗原表位肽的选择与合成根据人BPI基因组获得BPI N端的氨基酸序列(1-199aa)。采用DNAstar软件和瑞士生物信息研究所提供的ProtScale服务器等在线资源，结合BPI三维结构及表位分析的基本原理方法，对BPI N端氨基酸序列的抗原性、亲水性、可塑性、表面可及性和二级结构等理化特性进行分析；进而通过BLAST检索比较备选抗原表位肽与兔蛋白的同源性后，最终确定将BPI N端第22-36位氨基酸(简称TA)和第85-99位氨基酸(IKISGKWKAQKRFLK，简称IK)两条肽段，作为本研究所用的抗原表位肽。
2．抗原表位肽的血清学鉴定采用间接ELISA法，用市售抗BPI多克隆抗体，对TA/IK抗原表位肽进行鉴定。实验结果表明市售BP工抗体组OD450值(TA：0．661±0．072，IK：0．482±0．028，n=3)明显高于阴性对照组(TA：0．102±0．0．011，IK：0．069±0．014，n=3)，二者OD<,450>值存在显著性差异(TA：t=15．167，P=0．004，IK：t=19．529，P+0．003)，上述结果提示TA/IK抗原表位肽能被市售BPI多克隆抗体特异性识别结合，表明本实验选用的抗原肽确为存在于BPI N端的优势抗原表位。
3．抗原表位肽的偶联纯化及其浓度测定参照钥孔戚血蓝素(KLH)偶联试剂盒操作说明，将上述抗原表位肽与KLH进行偶联，获得相应偶联蛋白；通过凝胶过滤将其纯化后，参照BCA定量试剂盒操作说明，用酶标仪对纯化产物即TA/IK抗原表位肽-KLH偶联蛋白进行定量测定，结果显示TA偶联蛋白浓度为0．205 mg/mL，IK偶联蛋白浓度为0．229mg/mI。。
4．抗原表位肽抗血清的制备取纯化TA/IK抗原表位肽-KLH偶联蛋白液(TA浓度为0.205mg/mL，IK浓度为0.229mg/mL)lmL与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化呈“油包水”状态。取上述乳化抗原溶液在兔背部皮下多点注射(每点注射100μL)进行基础免疫；初次免疫后第14、21、28天加强免疫3次(以不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂，其余同上)。每次进行加强免疫前，耳缘静脉采血，通过间接ELIsA检测血清抗体效价。第4次免疫7天后，颈动脉放血分离血清。
5．抗原表位肽抗血清效价检测及特异性鉴定
(1)家兔第4次免疫7天后，耳缘静脉取血分离血清，以间接ELISA法测定TA/IK血清抗体效价分别为1：51200和1：12800。
(2)以市售BPI<,55>标准品为抗原，通过Western blot检测鉴定TA/IK抗血清与BPI<,55>结合的特异性，结果在转印膜上Mr约55 000处呈现特异性反应条带；而阴性对照组无任何条带，表明TA/IK抗血清能与BPIN端相应抗原表位特异性结合，可用来对BPI<,23>-Fc γ 1融合蛋白和BPI N端功能片段进行检测鉴定。
第二部分：TA/IK抗原表位肽的生物学活性研究
1.抗原表位肽的功能分析
(1)TA和IK抗原表位肽分别位于BPI N端第一和第二个功能区内(即第17-45位氨基酸和第65-99位氨基酸)，其氨基酸组成为TAALQKELKRIKIPD；IKISGKWKAQKRFLK。
(2) TA/IK 抗原表位肽疏水性氨基酸模序(B-X-X-X-B-B-B-X-B-B-X-B-X-X-B；X-B-X-B-B-B-X-B-X-B-B-B-X-X-B，其中X代表疏水性氨基酸，B代表任何非疏水性氨基酸)与具有中和内毒素和杀菌作用的抗菌肽通式即(X-B-B-X-B-X或X-B-B-B-X-B-X具有高度的相似性。
(3)根据TA/IK抗原表位肽疏水性氨基酸模序，同时结合BPI三维结构及其中和内毒素机制，提示TA和IK抗原表位肽应该具有杀菌和中和内毒素的生物学活性。
2.抗原表位肽体外生物学活性研究
(1)鲎实验证实，TA/IK抗原表位肽具有中和内毒素的作用，而且具有一定的剂量依赖关系。TA/IK抗原表位肽在15min即可发挥中和LPS的作用，30min中和作用达高峰；浓度为256pg/mL的TA抗原表位肽和浓度为64μg/mL的IK抗原表位肽可对1.0EU/mL LPS标准品产生中和作用。
(2)平板倾注法结果显示，浓度为256μg/mL IK抗原表位肽对Ecoli DH5α(5×10<4>CFU/mL)能够产生明显抑杀作用，且具有一定的剂量依赖关系；而TA抗原表位肽对相同浓度的Ecoli DH5a未能显示抑杀作用。