论文部分内容阅读
目的：钙网蛋白(calreticulin, CRT)广泛存在于各组织细胞中,是内质网(ER)腔内一种主要的钙离子结合蛋白。近年来文献报道,CRT在各种疾患的免疫应答调节中发挥重要作用,而在急性应激或炎症介导的神经免疫调节中却少有报道。本实验旨在观察电针(Electroacupuneture, EA)对不同年龄创伤大鼠的免疫调节作用,探讨大脑皮层钙网蛋白(CRT)在电针调节免疫抑制中的作用。方法：(1)选择3月龄(Adult,3-mon)和18月龄(Aging,18-mon)雄性SD大鼠,建立大鼠创伤应激模型,电针双侧足三里穴(ST36)和三阴交穴(SP6),CCK-8法检测脾脏淋巴细胞增殖功能和自然杀伤细胞活性,Western-Blotting、免疫组织化学法检测大脑皮层CRT、c-Src的表达。(2)免疫荧光双标结合激光共聚焦检测检测CRT与c-Src、霍乱毒素结合蛋白(CTB)的共存。(3)侧脑室(intracerebroventricular; icv)注射CRT全硫代反义寡聚核苷酸(Phosphorat-hioate antisense oligodeoxy nucleotides, PS-ASODN),观察中枢CRT在电针调节外周免疫应答的作用(脾脏淋巴细胞增殖功能和自然杀伤细胞活性)。(4)原代培养大脑皮层神经元体外培养10天,观察CRT与c-Src、CTB及LPS的调节作用。结果：(1)不同年龄大鼠创伤应激后,脾脏免疫功能受限,表现为淋巴细胞增殖功能减弱,自然杀伤细胞活性降低。电针可显著改善创伤应激对淋巴细胞增殖功能和自然杀伤细胞的抑制,对3-mon大鼠效果明显强于18-mon大鼠,而对18-mon大鼠电针效果不显著。(2)免疫荧光双标结果显示,大脑皮层CRT与神经元(NeuN)存在共存,而与星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(CDllb)共表达不明显。(3)创伤后大脑皮层CRT表达显著增多。(4)激光共聚焦与免疫荧光双标检测表明,创伤应激后大脑皮层神经元中CRT与c-Src、霍乱毒素结合蛋白(CTB)共存现象明显增加。(5)原代培养大脑皮层神经元LPS刺激后1h,CRT与c-Src表达显著升高。(6)侧脑室注射PS-ASODN可显著抑制中枢CRT表达,并能改善应激大鼠淋巴细胞增殖功能和自然杀伤细胞的抑制,而在电针调节免疫功能方面作用不明显。结论：(1)大鼠创伤应激后,可明显诱导不同年龄大鼠的外周免疫抑制作用,18-mon大鼠的免疫抑制更明显,且迁延时间长于3-mon大鼠,而电针可改善创伤应激介导的免疫抑制,且3-mon大鼠效果强于18-mon大鼠。(2)正常大鼠大脑皮层CRT主要存在于神经元中。(3)大鼠创伤应激后,大脑皮层神经元CRT表达增加,且主要集中在细胞膜脂筏。(4)中枢CRT可能参与创伤应激的外周免疫应答过程,而不参与电针的免疫调节作用。研究结果提示,创伤应激诱导CRT在神经元细胞膜脂筏的表达,因此神经元有可能成为免疫攻击的对象或作为抗原递呈细胞而参与免疫应答,而电针可能通过其它途径进行神经免疫调节。