脉络膜恶性黑色素瘤(choroidal melanoma，CM)是成年人最常见的眼内原发恶性肿瘤之一。CM恶性程度高，可侵及单眼和双眼，对视力损害极大，并可危及生命。脉络膜黑色素瘤传统治疗方法是眼球摘除术，近年来，随着早期准确诊断和及时治疗病例的增加以及新技术的应用，在发达国家，眼球摘除术已经较少应用；更多地是根据肿瘤的大小、位置和范围以及分类、分别提出了光凝治疗、冷冻治疗、巩膜板放疗、温热治疗、眼球摘除、眼内容剜除等相对适应症和综合治疗等，大大提高了治疗效果。而在我国，眼球摘除仍是主要的治疗方法，为保住患眼，其他的治疗方法已越来越多地被关注，但肿瘤的复发和转移是其主要问题。因此对CM发病机制、早期诊断及治疗的研究一直是肿瘤学家及眼科工作者要攻克的重点和难点，并具有非常重要的现实意义。 体外研究显示，肿瘤内的肿瘤干细胞具有维持肿瘤无限增殖以及药物抗性的作用。因此肿瘤对化疗药物容易形成耐药，直接影响治疗效果。在我院的病例中，曾有使用深低温冷冻治疗视网膜母细胞瘤患者，治疗后视网膜母细胞瘤退变消失，患者的视力保持良好。在肿瘤治疗领域中，深低温冷冻治疗也显示了很好的治疗前景。 为了验证脉络膜黑色素瘤中存在肿瘤干细胞，并明确深低温冷冻对肿瘤干细胞的作用，及引起肿瘤细胞退变消失的机制，我们进行了脉络膜黑色素瘤中肿瘤干细胞(choroidal melanomastemcell,CMSC)的分离培养，研究其生物学特性。在分离纯化成功后，进一步研究深低温冻融对肿瘤干细胞的杀伤作用，以及引起肿瘤细胞退变的机制，为脉络膜黑色素瘤的临床治疗提供新思路。 1.研究目的： 通过对OCM-1细胞中肿瘤干细胞的分离培养，验证脉络膜黑色素瘤中存在着肿瘤干细胞，进一步纯化肿瘤干细胞后，研究其生物学特性。利用深低温反复冻融对肿瘤干细胞进行杀伤，观察杀伤作用，并分析杀伤的可能机制。 2.实验方法： 使用无血清化学限定培养基(serum-free medium，SFM)，分离纯化培养肿瘤干细胞，观察细胞生长的变化。使用CD133，Musashi-1免疫细胞染色，诱导分化，动物实验研究肿瘤干细胞的生物学特性。 深低温反复冻融肿瘤细胞和肿瘤干细胞后，MTT法，克隆实验检测细胞抑制情况，HE染色，电镜观察细胞形态学变化。 使用P16，Hoechst 33342免疫细胞化学染色，流式细胞仪检测CD40及细胞膜电位的变化，并使用共聚焦显微镜观察细胞内钙离子的变化。 3.结果： 3.1用SFM培养基培养后，细胞均为悬浮团状集落生长，呈现典型的干细胞生长方式，CD133,Musashi-1阳性表达，并可以分化为HMB45，GFAP，S100，NSE阳性的细胞。1×105个CMSC细胞就可以在Balb/c裸小鼠体内成瘤，而注射1×105个OCM-1细胞的Balb/c裸小鼠均未成瘤。 3.2冻融后OCM-1细胞出现大量的凋亡细胞，而CMSC则以坏死为主，凋亡细胞少见。电镜下观察到冰晶的结构特征。 3.3激光共聚焦显微镜观察发现，冻融次数的增加，OCM-1细胞凋亡率增高。0.5×3组凋亡细胞最多，达到51％。流式细胞仪测定显示冻融后细胞膜电位下降，冻融前后CD40阳性细胞比率差异明显，且呈一定的量效关系。共聚焦显微镜观察到冻融后细胞发生较高比例的凋亡，细胞内钙离子浓度随着细胞凋亡比率的增高而升高，Western blot检测显示细胞冻融后survivin蛋白表达增加。 4.结论： 4.1脉络膜黑色素细胞中存在肿瘤干细胞，肿瘤干细胞具有分化和增殖的能力，且表现出更强的致瘤性。 4.2反复-70℃冻融对分化良好的OCM-1细胞主要是诱导其凋亡。而OCM-1中存在的肿瘤干细胞CMSCs对冷冻更加敏感，冻融后大量死亡，这是肿瘤在冷冻治疗后发生退变消失的根本原因。 4.3冻融杀伤OCM-1瘤细胞的机制主要为冰晶损伤及诱导凋亡。其机制与线粒体膜电位，P16表达下调，细胞内钙离子浓度增加有关。冻融后瘤细胞坏死因子CD40表达增强，可能是增强机体的免疫应答，介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理。