研究背景:血栓形成是由于血小板活化和凝血系统激活而导致的血液凝固。动脉血栓形成可引起心肌梗塞和脑中风,严重威胁人类健康。据2017年Lancet杂志报道,在40岁以上的人群中,心脑血管血栓性疾病是全球人口最主要的死亡原因。目前,有效的防治血栓性疾病的药物非常有限,其主要原因是动脉血栓形成机制异常复杂。因此,阐明动脉血栓形成调控机制,对于防治动脉血栓形成和降低心脑血管性疾病的死亡率,具有极为重要的临床意义。最新研究显示,蛋白二硫键异构酶家族在血栓形成中发挥重要的调控作用。蛋白二硫键异构酶家族是一类具有催化蛋白质新生肽链中二硫键的氧化,还原和异构功能的酶的总称,这一家族包括PDI、ERp57和ERp72等多个成员。另一方面,该家族在细胞外对蛋白的结构与功能同样发挥重要作用。研究显示,多个二硫键异构酶之间存在分工协作,共同调控细胞的正常功能。ERp57是蛋白二硫键异构酶家族主要成员之一。使用ERp57抑制剂的研究显示,ERp57调控多种刺激剂诱导的血小板聚集以及体内血栓形成。但是抑制剂无法判定ERp57在血栓形成中的生理作用;另外ERp57调控血栓形成的作用机制,尤其是是否调控以及如何调控血小板整合素αⅡbβ3的功能仍然不清楚。ERp57蛋白含有两个CGHC催化活性位点,它们在血小板聚集中分别发挥什么作用也有待研究。ERp72是另一个蛋白二硫键异构酶家族成员,其分子中共包括三个CGHC催化活性结构域。ERp72与ERp57之间的同源性较高。与ERp57一样,血小板活化之后,ERp72也被释放到血小板表面。但是,目前有关ERp72在血小板活化中的作用及机制完全未知。研究目的:本课题的研究目的包括:1.阐明血小板衍生的ERp57在血栓形成中的特异性生理作用,并揭示其调控血小板活化和血栓形成的分子机制。2.判定ERp72蛋白在血小板活化中的作用及相应的机制。3.检测ERp57与ERp72在血小板活化中的作用是否相同。研究方法:本课题应用活体荧光显微镜技术和氯化铁(FeC13)诱导的血栓形成模型,观测和比较野生型与血小板特异性ERp57敲除小鼠(PF4-Cre/ERp57-/-)的血栓形成表型,从而研究血小板来源的ERp57在体内血栓形成以及血小板集聚中的作用;利用整合素β3敲除小鼠研究了 ERp57调控血管损伤部位血小板积聚的作用对整合素αⅡbβ3的依赖性;应用流式细胞术和整合素β3敲除小鼠血小板,判定ERp57在血小板活化中的作用靶点;使用巯基标记的方法检测了 ERp57对整合素αⅡbβ3分子中巯基-二硫键转换的调控;使用ERp57不同催化活性结构域的突变蛋白,明确了 ERp57分子中两个催化活性结构域在血小板聚集中的不同作用。为了研究了 ERp72在血小板集聚中的作用,检测了 ERp72的抑制性抗体ERp72对血小板聚集的干预效应,并应用各个不同的催化活性位点的突变蛋白,进一步确定了ERp72的作用位点;使用ERp72基因敲除小鼠(Tie2-Cre/ERp72-/-)和氯化铁诱导的血栓形成模型,判定ERp72在血栓形成中的作用;使用巯基标记的方法检测ERp72对αⅡbβ3分子中二硫键氧化还原的调控作用;使用基因敲除小鼠和突变蛋白,检测ERp72和ERp57在血小板聚集中的不同作用。使用巯基标记和质谱分析,检测血小板活化过程中巯基-二硫键的变化。研究结果:(1)在氯化铁诱导的血栓模型中,PF4-Cre/ERp57-/-小鼠血管闭塞时间延长,并且尾巴出血时间延长。(2)ERp57调控血管损伤处血小板的积聚,并且ERp57的调控作用依赖于整合素αⅡbβ3。(3)ERp57敲除血小板整合素αⅡbβ3活化减弱,铺展及血块回缩受抑制,说明ERp57调控血小板整合素αⅡbβ3的活化和αⅡbβ3介导的血小板功能。(4)活化血小板表面ERp57的数量和还原活性均明显增加,抗ERp57抗体抑制血小板表面的还原酶活性,提示血小板表面ERp57的动态表达与血小板活化相关。(5)与野生型血小板相比,β3-/-血小板表面结合的ERp57蛋白量明显降低,说明ERp57与血小板整合素αⅡbβ3之间存在结合。(6)ERp57 N-末端CGHC活性位点抑制血小板聚集,与之相反,C-末端CGHC活性位点促进血小板聚集,说明C-末端CGHC活性位点在血小板聚集中发挥重要作用。(7)ERp57 C-末端CGHC活性位点增加αⅡbβ3分子中游离巯基的数量,说明ERp57 C-末端CGHC活性位点调控αⅡbβ3分子中二硫键的还原反应。(8)抗ERp72多克隆抗体特异性识别重组ERp72蛋白以及血小板中的ERp72抗原,并特异性抑制ERp72蛋白的还原酶活性。(9)抗ERp72多克隆抗体以浓度依赖性的方式抑制血小板聚集,说明ERp72在血小板聚集中具有重要作用。(10)ERp72C-末端的两个CGHC催化活性位点的突变蛋白明显抑制血小板聚集,说明ERp72通过C-末端的两个CGHC催化活性位点,调控血小板聚集。(11)血管内的ERp72调控血管损伤部位血小板的集聚,说明ERp72在体内血栓形成中具有重要作用。(12)重组野生型ERp57蛋白能够恢复ERp57基因敲除血小板聚集功能的缺陷;相反,重组野生型ERp72蛋白没有这种作用,说明ERp72和ERp57在血小板聚集中具有不同的作用。(13)ERp72与血小板表面整合素αⅡbβ3结合。(14)ERp72浓度依赖性地催化αⅡbβ3分子中游离巯基的数目,并且与ERp57或者PDI的作用效应不同。(15)质谱分析发现,血小板活化时,αⅡbβ3中产生了新的自由巯基。研究结论:血小板来源的ERp57调控体内血栓形成,血管损伤部位血小板积聚和整合素αⅡbβ3介导的血小板功能;ERp57结合于血小板表面整合素αⅡbβ3,并调控β3分子中二硫键的还原,从而调控血小板活化;ERp57C-末端催化活性结构域在血小板聚集和整合素αⅡbβ3分子中二硫键的还原中具有重要作用。ERp72在体内血栓形成中发挥重要生理作用;ERp72的第二个和第三个CGHC催化活性结构域在血小板聚集和αⅡbβ3二硫键的还原中具有重要作用;虽然ERp72和ERp57的分子结构相似,但是二者调控血小板活化的作用以及αⅡbβ3二硫键的还原效应不同。