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树突状细胞(DC)作为机体重要的一种专职抗原递呈细胞(APC),能有效活化初始T细胞。NK细胞可通过其表面NKG2D受体结合表达于DC表面的NKG2D配体。NK-DC之间的对话不仅影响天然免疫的功能,对获得性免疫的形成、发展及结果有深远的影响。为研究DC持续表达NKG2D配体对NK细胞免疫功能的影响,课题组前期制备了pCD86:RAE-1ε转基因小鼠,并完成转基因小鼠的筛选鉴定与免疫功能的初步分析,发现转基因小鼠体内NK细胞表面NKG2D下调、免疫功能低下的同时,CD4+T细胞表面NKG2D表达上调。本研究拟进一步探讨转基因小鼠体内NK细胞表面NKG2D下调的机制,并对转基因小鼠体内异常增多的CD4+NKG2D+T细胞亚群的功能及其表型特征进行深入研究。研究内容分为2部分：1.pCD86:RAE-1ε转基因小鼠体内NKG2D介导的NK细胞功能分析目的：观察pCD86:RAE-1ε转基因小鼠体内NKG2D介导的免疫功能变化,探讨体内NK细胞NKG2D表达下调的机制。方法：首先利用免疫荧光技术检测转基因小鼠的肝、肾、胸腺、肺、肠等组织中I-A/I-E细胞表达RAE-1ε的情况,基于流式细胞术分析转基因小鼠脾脏内各免疫细胞表面RAE-1ε的表达。其次分析转基因小鼠脾脏NK细胞的频率及其NKG2D表达的情况,利用CD107a标记法检测NK细胞对Ba/F3、Ba/F3-RAE细胞的杀伤活性；并体内观察转基因小鼠体内B16BL6-MICA、B16BL6细胞生长的情况,右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导肠炎发病的情况。另外,体外将转基因小鼠DC细胞、血清分别与正常小鼠NK细胞共培养,观察NK细胞表面NKG2D表达的变化。最后检测转基因小鼠CD4+T、 CD4+NKG2D+T细胞的频率,观察CD4+NKG2D+T细胞膜表面是否表达TGF-p,并将CD44+NKG2D+T细胞与正常小鼠NK细胞共培养,检测NK细胞NKG2D的表达。结果：转基因小鼠胸腺、肠道组织、肝脏内检测到I-A/I-E与RAE-1ε共表达的细胞,脾脏CD11c+、CD11b+、CD19+、Gr-1+细胞上调RAE-1ε的表达,而NK1.1+、CD3+细胞无RAE-1ε的表达。与对照小鼠相比,转基因小鼠脾脏NK细胞的频率无明显变化,但NKG2D表达下调至中等程度水平,NK细胞杀伤Ba/F3-RAE细胞的活性下降,而杀伤Ba/F3细胞的能力无明显变化。转基因小鼠体内B16-MICA细胞的生长速度快于对照小鼠,而B16细胞的生长速度在2种小鼠间无明显区别。DSS处理的转基因小鼠延缓了肠炎的发病。转基因小鼠来源的DC细胞体外刺激NK细胞5天后,上调NK细胞功能,而对NKG2D的表达无明显影响。转基因小鼠来源的血清对NK细胞表达NKG2D无影响。转基因小鼠脾脏CD4+T细胞频率无明显变化,而CD4+NKG2D+T细胞的频率明显上调。CD4+NKG2D+T细胞膜表面表达TGF-β,与NK细胞共培养后下调NKG2D的表达。结论：pCD86:RAE-1ε转基因小鼠体内出现异常增多的CD44+NKG2D+T细胞,其分泌TGF-β介导NK细胞下调表达NKG2D,并下调NKG2D介导的免疫功能。2.pCD86:RAE-1ε转基因小鼠体内CD4+NKG2D+T细胞的生物学特性研究目的：深入分析CD44+NKG2D+T细胞的效应功能及表型特点,探讨CD44+NKG2D+T细胞体外和体内的诱生机制,并初步鉴别CD4+NKG2D+T细胞与经典调节型T细胞(Treg)、Th17细胞的生物学特点。方法：首先观察正常小鼠CD4+T细胞过继输入至小鼠体内,其细胞表面NKG2D表达的变化。其次,通过胞内细胞因子法流式细胞术检测转基因小鼠、CT-26细胞荷瘤小鼠、对照小鼠体内CD4+NKG2D+T细胞分泌IL-10、TGF-β、FasL、IFN-γ的情况；并将CD4+NKG2D+T细胞与CD4+NKG2D-T细胞、CD8+T细胞共培养,观察其抑制效应性T细胞增殖的情况；观察CD4+NKG2D+T细胞胞浆内颗粒酶B、穿孔素的表达,及其杀伤靶细胞活性。另外,检测CD4+NKG2D+T细胞表面CD44、CD62L的表达分析该细胞的活化状态,检测其表面CD69、CD127、CD25、I-A/I-E、NKG2DL、CD28、CD152的表达。基于体外细胞实验,观察不同刺激剂诱导CD4+T细胞表面NKG2D的表达,并观察不同刺激剂对CD4+NKG2D+T细胞分裂的影响；基于小鼠体内B16-MICA、B16细胞荷瘤实验,体内观察肿瘤细胞表面MICA的表达对CD4+NKG2D+T细胞的影响。最后检测CD4+NKG2D+T细胞表达Foxp3、CD223、CD39,分泌IL-17A和RORγt的转录情况,以与Treg和Th17细胞相鉴别。结果：正常小鼠CD4+T细胞输入转基因小鼠后,明显上调了NKG2D的表达。转基因小鼠、CT-26荷瘤小鼠体内的CD4+NKG2D+T细胞表达FasL、高分泌TGF-β、IL-10,体外可抑制CD44+NKG2D-T细胞和CD8+T细胞增殖,胞浆内无颗粒酶、穿孔素分泌,无细胞毒活性,低分泌IFN-γ。CD4+NKG2D+T细胞以效应记忆型细胞为主,高表达CD69、 CD25、I-A/I-E、NKG2DL等活化分子。NKG2D在CD4+T细胞的诱导表达主要与TCR-CD3信号及NKG2DL的持续刺激有关,MICA阳性肿瘤细胞荷瘤小鼠体内CD4+NKG2D+T细胞的频率明显高于MICA阴性肿瘤细胞荷瘤小鼠。CD4+NKG2D+T细胞胞浆内无Foxp3转录,细胞表面无CD223表达,高水平表达CD39分子。另外,CD4+NKG2D+T细胞可中等程度分泌IL-17A,胞浆内低水平转录核因子RORyt。结论：pCD86:RAE-1ε转基因小鼠、CT-26荷瘤小鼠体内均出现一群CD4+NKG2D+T细胞,该T细胞亚群主要分泌IL-10. TGF-β和sFasL,发挥免疫调节功能。CD4+NKG2D+T细胞是不同于Treg细胞的一种调节CD4+T细胞亚群。MICA阳性肿瘤个体内诱生的CD4+NKG2D+T细胞可能参与了肿瘤免疫逃逸过程。