帕金森病(Parkinson’s disease PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病,其病理变化主要是中脑的黑质及其上行的黑质纹状体通路发生变性,脑内多巴胺神经元(DN)缺失,引起脑内多巴胺含量显著减少,导致缓慢发生的运动减少、静止性震颤、肌强直及体位不稳等锥体外系症状。帕金森病病因未完全清楚,尚无特效治疗,目前主要为药物治疗和手术治疗,但均为对症治疗,只能使患者的症状在一定时间内获得一定程度的好转,无法阻止该病的自然进程。现在,随着分子生物学及移植免疫学等新兴学科的发展,细胞移植治疗越来越受到人们的关注,为帕金森病的治疗提供了一个新的研究方向,干细胞移植中的骨髓基质干细胞(bone marrow stromalcells,BMSCs)可以分化为神经元,替代受损的DN,而且来源于自体,取材方便,不存在排斥及伦理问题,是目前国内外认为具有广泛研究前景的治疗方法。目前对于BMSCs移植治疗帕金森病的体外研究报道较多,如何进行活体的示踪研究受到越来越多国内外同行的关注,同时确定出最佳的BMSCs移植剂量也成为目前帕金森病实验研究的重要任务。PD患者黑质中还原型谷胱甘肽(GSH)大量减少,与疾病的严重程度呈正相关,具有一定特异性。有研究将BMSCs移植至大鼠PD模型的纹状体内,同时每天腹腔注射GSH作为辅助治疗,显示GSH对PD大鼠可能具有神经保护作用,但GSH是否具有促进细胞迁移的作用仍然不明确。本组研究利用超顺磁性氧化铁(Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)纳米粒子Resovist标记不同数量的BMSCs定向移植入大鼠PD模型的受损纹状体内,然后应用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈(Micro-47)对其进行活体示踪观察,最后,结合病理学,评价在应用1.5T超导磁共振成像仪,同时采用显微线圈的条件下对Resovist标记的BMSCs定向移植PD大鼠模型纹状体后进行活体示踪观察的可行性及可靠性,筛选出最优化的移植细胞数量及观察时间,并观察还原型谷胱甘肽对PD大鼠是否存在神经保护及促进BMSCs迁移的作用。本研究分为两个部分。第一部分PD大鼠模型纹状体定向移植Resovist标记BMSCs MRI活体示踪观察目的:采用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈对不同数量的Resovist标记BMSCs定向移植入大鼠PD模型的受损纹状体后进行活体动态观察,筛选并确定在本组研究条件下进行PD大鼠定向移植BMSCsMRI活体观察的最佳移植细胞数量及最佳观察时间。方法:(1)制作大鼠PD模型;(2)制备BMSCs;(3)Resovist、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)体外标记BMSCs;(4)实验分组:根据移植经Resovist标记BMSCs的数量不同,将40只PD大鼠分为五组,每组各8只大鼠,实验组共4组,移植数量分别为:第1组:1×10~5;第2组:1.5×10~5;第3组:2×10~5;第4组:2.5×10~5;对照组即第5组,注射生理盐水;(5)Resovist及Brdu标记的BMSCs定向移植入PD大鼠纹状体;(6)MRI活体示踪观察:使用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈,采用快速自旋回波-T1加权成像(TSE-T1WI)、快速自旋回波-T2加权成像(TSE-T2WI)、梯度回波-T2加权成像(FFE-T2WI)三个序列在移植细胞前、移植细胞后第1周、第4周、第8周、第12周对上述五组大鼠进行MRI检查,观察PD大鼠脑内信号改变,选择最敏感的MR扫描序列,在最优观察序列上测量并比较不同细胞移植数量组在各观察时间点脑内低信号区域的体积大小变化及信号强度改变,评估不同数量的移植细胞各观察时间点在大鼠脑内的迁移情况;(7)阿朴吗啡旋转试验:在移植细胞前、移植细胞后第1周、第4周、第8周对上述五组大鼠进行阿朴吗啡旋转试验,观察PD大鼠模型的行为学变化,与MRI结果进行对比观察;(8)病理学检查:移植细胞后第12周,于MRI检查后立即处死大鼠取脑组织,进行免疫组化染色及荧光定量PCR检查,与MRI结果进行对比观察。结果:1、在采用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈条件下,TSE-T1WI、TSE-T2WI和FFE-T2WI三个序列中,FFE-T2WI序列为Resovist标记BMSCs MRI活体示踪观察最敏感的序列;2、各实验组PD大鼠立体定向移植经Resovist标记的BMSCs后,均于FFE-T2WI序列显示大鼠移植侧脑纹状体区的低信号区,并且在同一观察时间点随移植细胞数量增多,低信号区体积有逐渐增大的趋势,而对照组未显示相应部位的低信号区;3、在第8周及其以后各实验组PD大鼠移植侧脑纹状体区的低信号区体积均随时间推移变小;第3组(2×10~5)和第4组(2.5×10~5)在第4周的低信号区的体积大于第1周,但仅第3组在第4周与第1周两个观察时间点的低信号区体积之间有显著性差异;第1组(1×10~5)和第2组(1.5×10~5)在第4周低信号区体积与第1周差别不大,无明显统计学差异;在同一观察时间点各实验组低信号区的信号强度之间均无明显统计学差异,而各实验组内在移植BMSCs后第1周-第12周的不同观察时间点之间低信号区的信号强度均有明显统计学差异,随时间延长信号强度增加。第3组(2×10~5)及第4组(2.5×10~5)各有3只大鼠在同侧纹状体和对侧室管膜同时出现低信号区,免疫组化显示相应部位存在Brdu阳性细胞;4、各实验组随时间延长阿朴吗啡旋转试验旋转次数逐渐减少,组内各时间点间均有明显统计学差异,第3组(2×10~5)每分钟旋转次数降低幅度最大,与对照组有统计学差异;5、免疫组化及荧光定量PCR检查结果:移植的细胞可沿着一定的路线发生广泛的迁移,少数可迁移到对侧的纹状体和室管膜。移植的BMSCs可以向其他神经元转化,以GFAP的表达量最多。第3组(2.0×10~5)的GFAP、NSE、TH及Nestin mRNA的表达量均为最高,且与对照组有明显统计学差异。结论:1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈对SPIO(Resovist)标记的BMSCs立体定向植入PD大鼠纹状体后的活体动态示踪观察:1、在TSE-T1WI、TSE-T2WI和FFE-T2WI三个成像序列中FFE-T2WI为MRI活体观察SPIO标记BMSCs的最佳序列;2、各实验组比较2.0×10~5可作为PD大鼠纹状体立体定向移植BMSCs活体1.5T MRI观察的最佳剂量,行为学试验及实时荧光定量PCR检查结果显示2.0×10~5BMSCs移植后PD大鼠行为学改善情况及BMSCs神经元转化情况亦为最佳,与MRI结果一致;3、PD大鼠纹状体立体定向移植BMSCs后第1-4周作为1.5T MRI活体最佳观察时间。第二部分PD大鼠模型纹状体定向植入Resovist标记BMSCs和腹腔注射GSH后MRI活体示踪观察目的:采用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈观察GSH对移植BMSCs的PD大鼠的神经保护作用。方法:(1)在第一部分的基础上,选择PD大鼠纹状体定向移植经Resovist标记的BMSCs MRI示踪观察的最佳移植细胞数量——2.0×10~5进行PD大鼠纹状体区定向移植,方法与第一部分相同。(2)将18只PD大鼠分为3组:实验组共2组,第1组:7只,在移植2.0×10~5BMSCs后第2周腹腔注射GSH,125mg/kg,每日一次,共4周;第2组:7只,仅移植2.0×10~5BMSCs;对照组即第3组:4只,注射生理盐水。(3)三组PD大鼠于实验组移植BMSCs或对照组注射PBS后第2周、第3周、第4周、第6周(即第1组腹腔注射GSH后当天、第1周、第2周、第4周)用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈进行MRI FFE-T2WI序列检查,观察PD大鼠模型脑内信号强度变化,测量并比较三组大鼠脑内低信号区体积大小及随时间变化趋势,同时进行阿朴吗啡旋转试验,观察并比较三组大鼠的行为学改变情况。(4)三组PD大鼠于第1组注射GSH后第4周MRI检查后立即处死大鼠,进行免疫组化染色和实时荧光定量PCR。结果:1、三组PD大鼠,两个实验组均于MRI FFE-T2WI序列显示大鼠移植侧脑纹状体区的低信号区,而且随时间延长低信号区体积逐渐增大,于移植BMSCs后第3周至第4周之间增大幅度最大,有明显统计学差异,第4周后仍有增大的趋势,但增大幅度明显减小,无明显统计学差异,与第一部分结果一致;在相同观察时间点各实验组之间低信号区的信号强度无明显统计学差异,各实验组内不同观察时间点间低信号区的信号强度均有明显统计学差异,随时间延长信号强度逐渐增加;2、第1组于注射GSH后第2、4周(即移植BMSCs后第4、6周)低信号区的体积略大于第2组,但二者无明显统计学差异;3、阿朴吗啡旋转试验第1组大鼠的旋转次数减少幅度较第2组明显,二者有明显统计学差异;两实验组大鼠阿朴吗啡旋转试验旋转次数减少的幅度与对照组相比均有明显统计学差异;4、实时荧光定量PCR显示移植的BMSCs可向其他神经元转化,以GFAP的表达量最多;第1组的GFAP、NSE、TH及Nestin mRNA的表达量均为最高,且与第2组有明显统计学差异。结论:1、GSH可使PD大鼠的行为学明显改善,并可诱导BMSCs分化为神经元样细胞,从而发挥神经保护作用;2、应用1.5T超导磁共振成像仪和显微线圈观察腹腔注射GSH(125mg/kg)对PD大鼠纹状体定向移植2.0×10~5Resovist标记的BMSCs迁移的影响,未见到有明显统计学意义的变化。