研究背景： 肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺血管壁增厚、重建为重要特征的肺血管疾病，而慢性低氧是引起肺动脉高压的主要因素，低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)发生发展的病理基础主要包括低氧性肺血管收缩、PASMCs 的肥大和增生以及肺血管重建。它是许多慢性阻塞性肺疾病的最终死亡原因。细动脉壁增厚和无肌细动脉肌化是肺动脉高压的病理学改变的特征。 除血管内皮细胞分泌血管活性成分以旁分泌的方式调节血管平滑肌舒缩和增殖外，血管平滑肌细胞本身也能以自分泌的方式产生许多血管活性成分。 内皮细胞的损伤，调节平滑肌细胞舒缩的细胞因子网络失调以及PASMCs 增殖和血管壁重建都是肺动脉高压发生发展的重要因素。内皮素-1(endothelin-1,ET-1)具有强烈的收缩血管的作用，而且其缩血管效应持久，参与血压的长期调节。内皮素还具有生长因子样作用，可通过激活原癌基因促进平滑肌和心肌细胞的增殖。肺血管内皮细胞通过旁分泌血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)，与受体结合后促进细胞增殖。电压门控钾通道(voltage-gated K+ channels,KV channels)在维持血管平滑肌细胞的膜电位和调节膜电位中起重要作用。KV 通道已被证实在低氧性肺动脉血管收缩起介导作用。在静息膜电位状态下，L 型电压敏感型钙通道(voltage-sensitive L-type Ca2+ channel)间断性地开放，当KV 通道表达受抑制或活性减低时，细胞膜去极化，L 型电压敏感型钙通道间断性地开放，钙离子沿着一万倍的细胞内外钙离子浓度差内流，同时细胞内钙离子库释放出钙离子，细胞内游离钙离子浓度增加，导致细胞收缩和细胞增殖。在肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中，KV2.1 通道是重要的一种钾通道类型，本实验选取其作为观察指标。 丹参具有多种生物活性，如抗增殖、抗菌、抗肿瘤、抗血栓形成、抗炎和抗血小板聚集等活性，并被广泛用于治疗高血压和心绞痛等心血管疾病，取得良好疗效。研究表明丹参提取物可显著降低低氧引起的肺动脉压升高，但其中的哪种成分起了作用，通过何种机制发挥作用仍未阐明。丹参酮IIA磺酸钠(sodium tanshinone IIA sulphonate,STS)，是丹参提取物之一丹参酮IIA的水溶性衍生物，本实验拟观察其对低氧培养的PASMCs 的增殖、ET-1 分泌及KV2.1 通道的影响，探讨STS 治疗HPH 的可能机制。 研究目的： 研究表明，慢性低氧可导致肺动脉高压，却不导致高血压。本实验目的是探讨ET-1 和VEGF 在肺动脉和体循环动脉对低氧的这种反应差异性中是否起作用及其在HPH 发生发展中的作用；观测KV2.1 通道在HPH 模型中及低氧条件下培养的PASMCs 的表达；观测低氧和常氧状态下STS 对PASMCs的增殖，其分泌ET-1 及其对细胞膜KV2.1 通道表达的影响，探讨STS 降低HPH 肺动脉压力的可能机制。 研究方法： 本研究采用动物实验和原代培养细胞相结合的方法： （1）复制HPH 的动物模型，分别测定颈动脉收缩压、右心室平均压分别代表体循环动脉压力和平均肺动脉压力，采用放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)测定出、入肺血血浆、肺组织匀浆和体循环动脉组织匀浆的ET-1 浓度，采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定出、入肺血血清的VEGF浓度；应用RT-PCR和Western blot印迹法等分子生物学方法分别检测HPH 时肺组织、肺动脉组织KV2.1 通道mRNA 和蛋白的表达变化。 （2）体外组织块法培养PASMCs；采用MTT 法检测低氧和STS 对PASMCs 增殖的影响；采用RIA 法观察低氧和STS 对PASMCs 的ET-1 分泌活性的影响；应用RT-PCR、流式细胞术和Western blot等检测低氧和STS 对体外培养的PASMCs 膜上KV2.1 通道表达的影响。 研究结果： （1）动物实验结果：HPH 大鼠模型被成功复制；HPH 大鼠血浆ET-1和血清VEGF 浓度明显增加，随低氧暴露时间的延长，出肺血中ET-1 增加更为明显；HPH 大鼠肺匀浆中ET-1 浓度较对照组中明显增高，但体循环动脉组织匀浆中ET-1 无明显差异；HPH 大鼠肺组织匀浆中的ET-1 浓度明显高于体循环动脉组织匀浆中ET-1 浓度；HPH 大鼠中肺组织、肺动脉组织中的KV2.1 通道mRNA 和蛋白较对照组明显减少。 （2）细胞实验结果：低氧诱导PASMCs 的增殖，而STS 可抑制低氧此诱导增殖的作用。低氧使PASMCs 的KV2.1 通道表达(mRNA 和蛋白水平)下降，同时低氧组PASMCs 培养液上清中的ET-1 含量较对照组增加，而STS可抑制低氧对PASMCs 的减少KV2.1 通道表达和增加ET-1 分泌的作用，这预示着STS 可能具有减少低氧性肺血管收缩和肺动脉高压的作用，使低氧时KV2.1 通道表达增加和减少低氧时ET-1 分泌则可能是丹参降低肺动脉高压压力的机制之一，这为用STS 治疗HPH 提供了理论和实验依据。 结论： 1、慢性低氧可使肺组织产生ET-1 和VEGF 增多，这可能是慢性肺动脉高压发生、发展的重要机制之一；HPH 大鼠的出肺血ET-1 增加的程度比入肺血高，HPH 大鼠肺匀浆中ET-1 浓度较对照组及低氧组体循环动脉匀浆中明显增高，说明低氧时肺动脉局部微环境中缩血管物质ET-1 浓度升高，这可能是低氧时肺动脉压增高的机制之一。低氧促进PASMCs 增殖、蛋白合成和分泌ET-1。 2、HPH 大鼠肺组织、肺动脉及低氧培养的PASMCs KV2.1 mRNA 和蛋白水平的表达均降低，这是HPH 时PASMCs 电生理学变化的物质基础。 3、STS 可抑制低氧对PASMCs 增殖和分泌ET-1 的促进作用，并可阻断低氧对PASMCs 上KV2.1 通道表达的抑制作用，这为STS 治疗HPH 提供了理论基础。