背景：　　 华蟾素注射液是中华大蟾蜍皮的灭菌水溶性制剂，广泛应用于多种恶性肿瘤及慢性肝炎。20多年的临床应用证实，华蟾素注射液单独应用能稳定或改善肿瘤病人病情，改善病人带瘤生存质量，且副作用小;联合化疗、放疗，能起到增效减毒的作用。近年来的体内外药理实验亦证明华蟾素注射液具有显著的抗肿瘤作用，镇痛作用及免疫增强作用。长期以来，微量的蟾毒内酯类成分（蟾毒灵，华蟾酥毒基及脂蟾毒配基）及吲哚类生物碱（蟾蜍噻咛）被认为是两类主要的活性成分。在本实验的前期预试中，我们发现该注射液中含有大量的肽类成分;而据文献报道，从蟾皮或蛙皮中分离得到的多肽存在着广泛而强大的药理活性，如抗菌、抗肿瘤、抗精子活性、抗病毒、镇痛等。因此，需要建立适当的模型对华蟾素注射液中的多肽成分进行活性筛选，并对其进行深入的分离与分析，为认识华蟾素注射液药效物质基础提供依据。　　 此外，华蟾素注射液经过水提醇沉工艺制得，虽然与蟾皮化学成分类似，但是在制备过程中必然会导致其化学成分的变化。迄今，即使是已知的两类成分（强心甾烯类及生物碱类），其在该注射液中的种类和含量，亦是知之甚少（仅有前述四种成分的报导）。因此，仍然缺乏对该注射液进行直接的、系统的成分研究。同时，目前的质量控制研究亦仅仅是基于采用比色法的测定总生物碱类物质，而未对其他物质（包括多肽成分，以及微量的、活性较强的且有毒的强心甾烯类成分）进行有效控制。因此，迫切需要采用现代色谱技术对华蟾素注射液中的微量蟾毒内酯成分及其主要的水溶性成分（包括多肽成分）进行全面的定性、定量分析，完善华蟾素注射液的质量控制，并为深入认识华蟾素注射液的内在物质基础提供科学依据。　　 目的：　　 1.从华蟾素注射液中分离富集得到多肽，对其进行鉴定和分析，并应用体内外模型对其药理活性进行评价，从而提升对该注射液物质基础的认识。　　 2.基于对华蟾素注射液的全组分分析，应用多种色谱技术，如液相、液质联用、气相等，对其微量的蟾毒内酯类化合物、主要的水溶性成分（如生物碱、碱基、核苷等）及多肽成分进行全面的定性与定量研究，阐明华蟾素注射液的化学成分组成，并完善其质量控制。　　 方法：　　 1.利用分子筛原理，采用葡聚糖凝胶G-50对华蟾素中间体中的多肽成分进行分离、富集，冷冻干燥后得到多肽样品;运用紫外、高效凝胶色谱及基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)质谱对华蟾素多肽进行定性研究，检测其溶解度、紫外吸收、分子量范围等特性，以对其进行表征;应用高效液相色谱法(HPLC)、离子交换法(IEC)及分子排阻色谱法(SEC)对多肽成分进行分离与分析，以对其成分进行鉴定。　　 2.建立体外肿瘤细胞模型，采用CTG法检测，观察多肽成分对6种人肿瘤细胞系（胃癌BGC823及MCG803，胰腺癌MIAPACA-2及ASPC-1，结肠癌DLD-1及HT-29）的抑制增殖作用;建立ICR小鼠体内模型，采用醋酸扭体法及热板法对多肽成分的镇痛活性进行检测。　　 3.运用快速液相联用四级杆-飞行时间质谱(RSLC-QTOF-MS)技术，将采集的色谱及质谱数据，结合文献及标准品比对，对华蟾素注射液中主要的水溶性成分进行在线分析，鉴别其主要化学成分。在指纹图谱研究基础上，选择恰当指标进行定量分析。　　 4.运用高效液相联用三重四级杆质谱（HPLC-QqQ-MS/MS）技术，结合文献及标准品比对，对华蟾素注射液中主要的蟾毒内酯类成分进行定性分析，并建立可靠的定量测定方法。　　 5.对华蟾素注射液中的多肽成分进行富集，应用紫外-可见分光光度法对双缩脲显色后多肽成分进行定量分析;同时，基于氨基酸分析，应用气质联用(GC-MS)法对衍生化后的游离氨基酸(FAA)和结合型氨基酸(CAA)进行定性、定量分析，以建立控制多肽类成分的方法。　　 结果：　　 1.葡聚糖凝胶G-50能对华蟾素中的多肽成分进行快速分离和富集，得到的多肽呈暗白色疏松粉末。有较好的水溶性，略溶于60％乙腈。其水溶液在220nm及275 nm处有最大吸收。运用SEC及质谱技术证实，这些多肽成分的分子量分布于0.2～8 kDa，集中于0.7～5 kDa。并且多肽组成较为复杂，液相、IEC及SEC或者联用均不能对其中的多肽进行明显的分离。　　 2.多肽成分在扭体法和热板法实验中均显示出一定的镇痛作用。在小鼠扭体实验中，与空白对照组比较，不同剂量的多肽样品（15 mg/kg，75 mg/kg）能显著减少小鼠的扭体次数，并有显著的统计学意义;在热板法中，在给药后60 min，对给予15 mg/kg及75 mg/kg多肽剂量的小鼠对热板疼痛的耐受明显较空白组增强，对疼痛的保护率分别为42.86％及65.71％。　　 此外，华蟾素多肽对6种体外培养的人肿瘤细胞均有一定的抑制增殖作用，且与等剂量的华蟾素注射液表现出类似的作用强度。72 h的IC50为25～123μg·mL-1，而对ASPC-1细胞的IC50为863μg·mL-1。　　 3.经RSLC-DAD-Q-TOF-MS分析，华蟾素注射液的水溶性成分主要含有生物碱、核苷、碱基、氨基酸以及一些寡肽、有机酸等。通过与文献比对，鉴定了25个化合物。11个化合物进一步用标准品进行了确认。13个化合物为首次从蟾皮或注射液中检测到。进而，采用HPLC-PDA法建立了华蟾素注射液指纹图谱。共41个共有峰，经对照品比对，确认了9个主要峰，包括5个碱基（尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤）、3个核苷（尿苷、鸟苷、腺苷）及1个生物碱（蟾蜍噻咛）。同时，针对这9个化合物，进行了HPLC-PDA的同时定量测定。为提高检测灵敏度和准确性，选取各个化合物的最大吸收波长选为检测波长。建立的方法简便、可靠:线性(r2，0.9996～1)、检测限与定量限（分别为0.0030～0.075μg·mL-1，0.010～0.150μg·mL-1），日内与日间精密度(RSD，0.02-1.45％)，重复性(RSD，0.05～2.13％)，稳定性(RSD，0.24～3.87％)，回收率(95.88～104.89％)。17批次的样品分析结果显示，9个化合物总含量的平均值为68.47μg·mL-1。　　 4.经LC-QqQ-MS/MS分析，8个微量的蟾毒内酯类化合物通过与对照品比对被鉴定，5个首次从该注射液中发现。8个鉴定的内酯类成分在MRM模式下进行了内标法定量分析。经方法学验证:线性(r，0.9979～0.9999)、检测限与定量限（分别为0.0030～0.075μg·mL-1，0.010～0.150μg·mL-1），日内与日间精密度(RSD，1.92～4.79％)，重复性(RSD，3.12～4.96％)，稳定性（RSD，2.84～4.45％），回收率(93.96～104.89％)，该方法可靠地应用于17批次样品的测定，8个化合物的总量在176.25～569.02 ng·mL-1之间，平均295.68 ng·mL-1。　　 5.采用合成多肽CL-705(MW3297)为标准品，建立了可靠的比色法测定经由葡聚糖凝胶G-10富集的华蟾素注射液多肽成分。获得了较好的线性0.9985，加样回收率在86～99％之间。9批样品测定结果表明华蟾素注射液中的多肽含量在0.16-0.29 mg/mL。　　 成功建立了GC-MS高效测定华蟾素注射液中的18种FAA和结合CAA的方法，方法取得了较好的线性范围(r2，0.9909～0.9999)，检测限和定量限（分别为2.5～10 pmol，3.3～20 pmol），日内与日间精密度（分别RSD≤4.63％及≤8.24％）。方法建立于优化后的Phenomenex EZ:faast试剂盒操作，阳离子交换SPE作为样品前处理方法能除去杂质背景干扰，提高响应值。注射液直接用于游离氨基酸测定，而结合氨基酸在酸水解后经调PH至1.5～5，便直接用于测定，方法简便。在6M盐酸水解结合氨基酸时，加入5％的巯基乙酸能降低水解过程中对部分氨基酸的氧化而提高响应。对于游离和结合氨基酸测定，该方法的重现性RSD值在10％以内，对大多数的氨基酸，游离及结合型氨基酸的回收率均大于80％。方法应用于5批注射液的测定，结果显示，华蟾素注射液中FAA和CAA的平均总含量分别在130.7～144.54μg·mL-1及436.93～526.95μg·mL-1范围。该方法对于间接评价华蟾素注射液中的多肽成分具有较好的适用性。　　 结论：　　 1.华蟾素注射液中的多肽成分较为复杂，且具有一定的镇痛作用和抗肿瘤作用，但是对于其作用机制值得进一步研究。　　 2.通过对华蟾素注射液全成分的分析，基本阐明了其主要的化学成分组成（微量的蟾毒内酯，生物碱，碱基，核苷，多肽，及氨基酸，有机酸等），且其蟾毒内酯成分、多肽成分及生物碱成分可能为其有效物质基础。经过多种色谱手段，成功建立了基于全组分的定性、定量方法，可以作为质量控制方法。