研究背景骨肉瘤是常见于儿童和青少年的原发性恶性骨肿瘤。新辅助化疗及手术是目前骨肉瘤患者治疗的主要方法,使患者的5年生存率达到了60-70%。然而,在过去几十年中,骨肉瘤患者的五年生存率未见显著提高,根本原因是肿瘤细胞对化疗药物有抗药性。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子APE1（Apurinic Apyrimidinic Endonuclease1）涉及多种肿瘤的化疗抵抗,主要定位于细胞核内。新近研究表明胞浆APE1高表达与多种肿瘤的预后不良和化疗抵抗相关^[1-2]。我们研究发现APE1主要定位于骨肉瘤细胞核内,核浆共表达与肿瘤的预后不良相关。进一步研究发现APE1具有线粒体定位序列,受到活性氧分子（Reactive Oxygen Species,ROS）刺激后可出现由细胞核至胞浆线粒体转位并抑制细胞凋亡。许多化疗药物除具有细胞毒性作用外,亦可通过ROS的产生诱导肿瘤细胞凋亡,是化疗药物抗肿瘤的重要机制之一。Angkeow等人发现胞浆APE1可通过调节Rac1蛋白协调线粒体NADPH氧化酶来抑制内皮细胞胞内ROS的产生,从而保护细胞^[3]。以上研究提示胞浆APE1可能参与了骨肉瘤化疗耐药的作用,而调控线粒体ROS可能是其重要机制之一。本研究旨在探究胞浆、线粒体APE1与骨肉瘤化疗抵抗的作用,验证APE1的表达水平及亚细胞分布的改变是否可作为预测骨肉瘤化疗敏感性的指标,并进一步探究线粒体APE1介导ROS对骨肉瘤化疗抵抗的作用与机制。此外,我们通过全转录组测序发现miR-767-5p在CDDP耐药人骨肉瘤细胞株中显著低表达。本研究中,我们证实了miR-767-5p过表达可以促进骨肉瘤细胞对放化疗的敏感性,同时促进肿瘤细胞的迁移能力,可能分别通过PLAC8、PEG10、AHR三个下游靶基因实现,其机制值得深入探究。我们以骨肉瘤耐药细胞株中胞浆APE1表达增高为线索,将线粒体APE1参与ROS调节机制作为切入点,结合miR-767-5p在骨肉瘤的化疗敏感性的作用,探讨胞浆APE1与miR-767-5p在调控骨肉瘤化疗耐药中的作用及其可能机制,为骨肉瘤的临床治疗提供新的思路。研究方法1.收集35例2013-2018年就诊于陆军特色医学中心,并接受铂类药物治疗的骨肉瘤患者的组织样本以及临床资料。利用免疫组化实验检测35例骨肉瘤患者组织样本中APE1的表达。评估铂类药物治疗疗效,将患者分为:（1）完全缓解（complete response,CR）:所有目标病灶完全消失,至少维持4周;（2）部分缓解（partial response,PR）:基线病灶最大径之和减少30%以上,至少维持4周;（3）病变进展（progression of disease,PD）:为基线病灶最大径之和增大20%以上或出现新病灶。利用统计学分析胞浆APE1表达情况与患者使用铂类药物治疗疗效的联系。2.利用细胞核与胞浆蛋白分离试剂盒,分离提纯HOS、9607、U2OS、SAOS2与U2OS（R）（CDDP耐药人骨肉瘤细胞株）骨肉瘤细胞株中细胞核与胞浆蛋白,并通过Western blot检测各骨肉瘤细胞系中细胞核与胞浆APE1的表达差异。3.利用靶向胞浆APE1定位慢病毒转染U2OS与9607细胞,构建胞浆APE1过表达细胞模型,并通过CCK8与流式凋亡实验验证过表达胞浆APE1可降低骨肉瘤对顺铂的敏感性。4.利用细胞核与胞浆蛋白分离试剂盒与线粒体蛋白分离试剂盒,分离提纯U2OS与U2OS（R）细胞中细胞核、胞浆、线粒体蛋白,并利用Western blot检测APE1的蛋白表达差异。5.利用APE1敲低慢病毒转染至U2OS、U2OS（R）与SAOS2细胞中,构建APE1缺陷型细胞模型,并通过Western blot、免疫荧光和CCK8实验验证敲低APE1可恢复CDDP耐药细胞株对顺铂的敏感性。6.利用靶向线粒体APE1定位慢病毒,构建线粒体APE1过表达细胞模型,并通过利用Western blot、免疫荧光和CCK8实验验证过表达线粒体APE1可提高骨肉瘤细胞对顺铂的耐受性。7.使用顺铂或过氧化氢处理各种骨肉瘤细胞模型,检测ROS的产量;使用活性氧去除剂（N-Acetyl cysteine,NAC）后,再次检测各细胞模型中ROS的产量,验证线粒体APE1可减少ROS的产生。8.通过Western blot验证线粒体APE1高表达通过磷酸化Rac1（P-Rac1）蛋白调节ROS的产生,并抑制烷化剂诱导的细胞凋亡。9.利用免疫组化实验检测7例骨肉瘤新鲜组织样本中APE1与γ-H2AX的表达,结合临床分析APE1表达与化疗耐药的联系。10.通过全转录组基因测序,检测CDDP耐药骨肉瘤细胞株中异常表达的miRNA。11.利用CCK8、克隆形成、Transwell实验分别检测差异miRNA基因对骨肉瘤的化疗,放疗和迁移能力的影响。12.利用测序数据与TargetScan.org、microRNA.org、miRDB.org数据库检索差异miRNA的下游靶基因,并利用RT-PCR与Western blot验证。研究结果:1.临床数据显示,骨肉瘤患者中胞浆APE1水平与铂类联合治疗的敏感性呈负相关,胞浆APE1高表达的骨肉瘤患者更易出现化疗耐药。35例患者中分别有9例、26例为胞浆APE1高、低表达。高表达组中,只有33.3%患者疗效评估为CR或PR,66.7%为PD。相反,低表达组中,76.9%为CR或PR,只有23.1%为PD。2.APE1同时定位于骨肉瘤细胞的细胞核与胞浆内,主要表达于细胞核内;CDDP耐药细胞株内胞浆APE1表达水平最高;顺铂能够促使骨肉瘤细胞内APE1从细胞核转移至胞浆。3.过表达胞浆APE1可降低骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性。我们利用U2OS和9607细胞建立胞浆APE1过表达细胞模型:U2OSsh APE1和9607sh APE1。CCK8结果显示U2OSsh CON、U2OSsh APE1、9607sh CON和9607sh APE1对应的顺铂IC50分别为9.885、12.879、2.43和3.39μg/ml。4.相较敏感株,CDDP耐药骨肉瘤细胞株中胞浆APE1与线粒体APE1显著高表达,细胞核APE1表达下调,呈现APE1从细胞核转移至线粒体的现象。5.敲低APE1,可恢复U2OS,U2OS（R）和SAOS2细胞对顺铂的敏感性。在APE1缺陷型细胞中,顺铂可诱导产生更多的DNA损伤与细胞凋亡。6.过表达线粒体APE1可降低U2OS与SAOS2细胞对顺铂的敏感性,减少细胞凋亡。我们利用U2OS和SAOS2细胞建立线粒体APE1过表达细胞模型,并命名为:U2OSmt APE1和SAOS2mt APE1。CCK8分析显示U2OSscr、U2OSmtAPE1、SAOS2scr和SAOS2mtAPE1对应的顺铂IC50分别为3.5、7.6、4.7和6.3μg/ml。7.线粒体APE1高表达可减少烷化剂诱导的ROS的产生与DNA损伤,沉默APE1可诱导ROS过量产生,促进骨肉瘤细胞凋亡。NAC可抑制ROS的产生,进而减少顺铂诱导的细胞凋亡,证明ROS的过量产生是顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的关键因子。8.线粒体APE1高表达通过磷酸化Rca1蛋白下调ROS促进骨肉瘤的化疗抵抗。9.骨肉瘤组织内APE1与γ-H2AX表达呈负相关,APE1高表达的患者对铂联合治疗反应差。10.通过全转录组基因测序,我们发现相较敏感细胞株,miR-767-5p在CDDP耐药骨肉瘤细胞株中显著低表达,可能为骨肉瘤的抑癌因子。差异microRNA表达变化2倍以上且P值≤0.05。11.miR-767-5p可促进骨肉瘤细胞对放化疗的敏感性,提高肿瘤细胞的迁移能力。12.我们将转录组测序结果与TargetScan.org、miRDB.org、micro RNA.org对比,检测8个miR-767-5p的下游靶基因,并通过RT-PCR验证,分别为:BASP1、FOXE1、AHR、PEG10、RPP25、ARHGEF5、SEMA3C、PLAC8。我们推测miR-767-5p可能分别通过PLAC8、PEG10、AHR发挥促肿瘤放化疗敏感性与细胞迁移的作用。研究结论1.胞浆APE1高表达与骨肉瘤细胞的顺铂抵抗相关,并且胞浆APE1高表达的骨肉瘤患者更易出现化疗耐药。2.骨肉瘤细胞中,胞浆中的线粒体APE1发挥着顺铂抵抗的主要作用。3.线粒体APE1高表达可通过磷酸化Rac1蛋白下调ROS的产生,进而减少顺铂诱导的DNA损伤与细胞凋亡。4.miR-767-5p作为抑癌基因,在CDDP耐药骨肉瘤细胞株中显著低表达,过表达miR-767-5p可促进骨肉瘤细胞对放化疗的敏感性,同时也提高了肿瘤细胞的迁移能力,对于miR-767-5p高表达的这部分骨肉瘤患者,在使用放化疗治疗的同时也会增加肿瘤远处转移的风险,对骨肉瘤患者的临床治疗与定期复查具有一定的指导意义。