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邻苯二甲酸酯(phthalate esters,PAEs)是一类广泛使用的增塑剂,随着时间的推移,可迁移到环境中产生污染,危害人体健康。常用的PAEs检测方法包括色谱分析法和免疫分析法,前者只能在实验室开展工作,后者只能识别一种或少数几种PAEs,无法满足多残留现场检测的要求,具有局限性。建立广谱、灵敏、快速的现场检测方法,实时监控多种PAEs残留,可提高检测效率,降低检测费用,对于保障食品安全具有重要意义。本研究基于过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)可特异性识别邻苯二甲酸酯类物质,建立白酒中PAEs多残留荧光偏振检测方法。与抗体相比,受体的优势在于可识别一类目标物,且更易大量制备,性质稳定。受体分析法通过测定样品中PAEs的总摩尔数,可评价PAEs混合物的总毒性当量及对健康的综合效应,因此更具实践意义。选择PAEs的高亲和力受体m PPARα为研究对象。为了提高可溶性表达效率,基于计算机辅助设计结果,对m PPARα-LBD受体模型的非底物结合区域进行了分子改造。运用基因重组技术,将m PPARα-LBD的N端氨基酸202-266切除,命名为m PPARα-LBD*(aa 267-468)。提取小鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增目的基因,构建表达载体p ET28a-m PPARα-LBD*,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析表明,杂蛋白基本被去除,获得带His标签的可溶性重组蛋白m PPARα-LBD*。浓缩后的重组蛋白的浓度为0.33 mg/m L。利用m PPARα-LBD*与探针的饱和结合实验,验证了重组蛋白结合配体的能力。以m PPARα-LBD*为识别元件,以C4-BODIPY-C9为荧光探针,进行荧光偏振检测分析。优化后的反应条件为:探针浓度40 n M,蛋白浓度80 n M,孵育时间10 min。竞争性结合反应表明,10种PAEs均可竞争受体的结合位点,以剂量依赖方式抑制C4-BODIPY-C9与m PPARα-LBD*的结合。荧光偏振分析对10种PAEs的检测限为0.7-11.2μM,其中,对白酒产品重点监控的DEHP和DBP的检测限分别为8.9和0.7μM,低于国家卫计委评估的安全浓度。采用水浴加热,除去白酒中的乙醇,消除基质对检测分析的干扰。空白白酒样品中添加DEHP和DBP的平均回收率约为80%,变异系数低于10%,重复性较好,基本可满足白酒样品检测的要求。为深入了解受体-配体的结合模式,以h PPARα-LBD为模板,同源模建建立m PPARα-LBD三维结构模型。应用分子对接,研究PAEs特征官能团与m PPARα-LBD*关键氨基酸残基的相互作用,发现两者的结合力以氢键和疏水相互作用为主。PAEs的苯环与F82、Y123、Y273的芳环有π-π堆积作用,且与F82形成了疏水作用。PAEs的两个酯基可与H249的N原子形成2条氢键,其中,DBP的一个酯基还与S89的羟基形成1条氢键,但DEHP在该位点并未形成氢键。PAEs的两条烷烃链伸入m PPARα-LBD*的两个通道,形成疏水相互作用。长链烷烃的结合力强于短链烷烃,支链烷烃的结合力强于直链烷烃,苯环的结合力强于环己烷。侧链与通道疏水作用的叠加效应对受体-配体结合能力的贡献大于氢键。在分子对接研究的基础上,计算结合自由能,比较10种PAEs的亲和力强弱,理论计算结果与实验测定结果的相关性较好(R2=0.948)。建立PAEs与m PPARα-LBD*线性构效关系模型,基于结合位点和对接打分值,可在理论上快速判别PPAR未知配体(不局限于PAEs)的亲和力,尤其适用于指导筛选新的生物惰性增塑剂,可提高筛选效率,减轻实验工作量。综上所述,基于受体识别建立白酒中PAEs多残留荧光偏振检测方法,未来可拓展应用于其它基质中的PPARs其它活性污染物检测。荧光偏振分析在均相体系中完成,无需ELISA的洗脱步骤,操作简单。白酒样品经水浴加热后,在反应体系中孵育10 min即可检测,耗时短。利用便携式、微孔板多功能荧光酶标仪,即可实现现场检测,适用于基层大批样品的高通量初筛。