一 研究背景（一）严重烧伤后，大量炎症介质释放，引起全身性炎症反应，TNFα、IL-1β、IL-6在其中起主导作用。 严重烧伤后，机体内环境发生一系列变化，伴随神经内分泌改变的应激反应，免疫系统被激活，大量炎症介质释放，引起全身性炎症反应。一些临床和实验资料表明，通常在创伤后数分钟至数小时已经存在全身性炎症。炎症反应在本质上是机体对致病因素侵袭的保护性反应，适度的炎症反应及适量的体液介质对于机体抵御损伤、促进修复具有积极意义。如果早期炎症反应在启动后就按自身正反馈的规律不断放大，迅速失控，或经历感染、延迟复苏等“二次打击”，诱发更剧烈的炎症介质释放，使失控的炎症反应不断发展，会造成广泛的自身组织损伤。临床上对烧伤后过度炎症反应综合征的治疗，注重于对原发因素的处理，如及时有效的液体复苏、抗生素治疗、早期切痂等，但对于已经启动的级联式炎症反应，仍无理想措施。良好的策略是设法降低已经激活的免疫反应，减少炎症介质释放。因此研究烧伤后炎症介质的来源及调控具有重要意义。 在已知参与炎症反应的100余种炎症介质中，TNFα、IL-1β、IL-6三种促炎性细胞因子在全身性炎症的发生发展中起主导作用。大量动物实验及临床病人的观察表明，严重烧伤早期上述三种促炎性细胞因子的血浆水平显著升高。TNFα是细胞因子网络的关键成份，是创伤后首先被释放的炎性介质，它可以进一步引起免疫细胞的激活，诱导其它细胞因子的产生，引起级联式炎症反应。外源性TNFα、IL-1β可以引起类似脓毒症的有关症状，而IL-6是创伤后第二军医大学 博士论文调节急性期反应的最主要的介质，是引起烧伤后高代谢的主要活性物质 （二）枯否细胞可能是烧伤后血浆 TNF a、IL－ID、IL－6 的主要来源 组织学上，巨噬细胞是释放 TNF a、IL习、IL－6 的最主要来源。枯否细胞的数量占巨噬细胞总数的80－90％，居于肝窦内战略要地，与门静脉血液直接接触，对血液起“滤过” 作用。然而，枯否细胞作为最大的巨噬细胞群体，在促炎性细胞因子的产生中起什么作用？也就是说，枯否细胞在烧伤后全身性炎症反应中的作用如何？现有的研究表明，除细菌、毒素外，缺血、缺氧状态以及异物、组织碎片、免疫复合物、炎症介质等物质随血液通过门静脉，也可以激活肝窦内枯否细胞。而活化后的枯否细胞会产生释放细胞因子、氧自由基、脂质介质、蛋白酶、一氧化氮等多种炎症介质。严重烧伤后，上述激活枯否细胞的因素或多或少地存在，势必会激活枯否细胞。另外，近年来烧伤后肠源性细菌、毒素移位观点的确立，进一步提示枯否细胞在烧伤后全身性炎症反应发生发展中的重要作用 （三）钙离子通道阻断剂可能是下调烧伤后 TNP a、IL－18、IL－6产生的有效手段 细胞内钙离子作为细胞内信号传导的第二信使，在枯否细胞的活化中起重要作用。许多物质作用于枯否细胞，均引起枯否细胞细胞内钙离子浓度升高，抑制细胞内钙升高，可以抑制枯否细胞的许多生物效应，包括释放TNF、血小板激活因子、氧自 由基等。在内毒素休克、肝脏移植等模型中，己经进行了钙离子通道阻断剂用于调控炎症介质释放从而减轻组织损伤的动物实验研究，并取得了预期效果上述的相关研究提示，钙离子通道阻断剂对于抑制枯否细胞的活性，减少炎症介质的释放，从而治疗烧伤后过度炎症性损害，可能具有一定的应用前景 3第二军医大学 博士论文二 研究目的 钙离子通道阻断剂用于严重烧伤后全身性炎症反应的研究，目前尚无相关报道。本课题以此为研究背景，在细胞和分子水平，探讨枯否细胞在严重烧伤早期导致全身性炎症反应的三个关键细胞因子 TNF a、IL－lp、IL－6 产生中的作用及机制，以及钙离子通道阻断剂尼莫地平调控三种促炎性细胞因子合成释放的可能性，为寻找到一种能用于烧伤临床治疗的有效减轻、控制过度全身炎症反应的措施提供理论依据。三 研究方法 （一）烫伤血清对大鼠枯否细胞分泌 TNF a、IL－18、IL－6作用的实验研究 用内灌注消化、密度梯度离心法分离培养大鼠枯否细胞；大鼠行 30％TBSA度烫伤，分离血清；用显徽荧光分光光度计复合倒置显微镜技术，动态观察在烫伤血清作用下的单个枯否细胞［C a‘门 i 变化；E LIS A 方法测定烫伤血清培养的枯否细胞上清中 TNF a、IL－lp、IL－6 浓度变化；观察尼莫地平、mRNA转录合成抑制 剂Actinomycin D、蛋臼质合成抑制剂CyCI。heXimid6对上述结果的影响。 （二）大鼠严重烧伤早期枯否细胞表达 TNF a、IL－lfi、IL－6 mRNA的改变 大鼠行 30％TBSA度烫伤后，用内灌注消化、密度梯度离心法分离枯否细胞；采用一步法进行枯否细胞总RNA的抽提；体外同位素’印?