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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身抗体介导的以对称性、多关节滑膜炎和进行性关节软骨、软骨下骨破坏为主要病理改变的慢性系统性炎症疾病,属于自身免疫性疾病,病因尚不明确。临床表现可以从轻度、自限性疾病发展为快速进行性炎症伴关节破坏,严重时可导致身体残疾。RA的血清学特征主要是产生针对免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)的抗体即类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和针对瓜氨酸化蛋白(citrullinated protein,CP)的抗体即抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibody,ACPA)。RA的发病机制尚未完全明确。ACPA被认为在RA的发病机制和病理过程中发挥重要作用。ACPA通过形成免疫复合物促进滑膜增生以及骨和关节的破坏,而CP是ACPA的主要靶抗原。各种原因导致的机体内CP异常增加,免疫系统识别异常的CP并产生与其特异性结合的ACPA。瓜氨酸是机体内一种非标准氨基酸,由精氨酸残基转化为瓜氨酸残基的蛋白质翻译后修饰过程产生,而这一过程的催化酶是精氨酸脱亚胺酶(peptidyl arginine deiminase,PAD)。PADs是一种由PAD1-4和6组成的钙依赖性酶家族。有证据表明,PAD2和PAD4参与RA的病理过程。PAD2和PAD4主要存在于外周血中性粒细胞和单核细胞中,而这两种细胞在RA病理过程中发挥不同的作用。目前,关于治疗RA药物对PADs影响的研究尚不多见。艾拉莫德(iguratimod,IGU)是一种新型合成小分子改善病情抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drug,DMARD),在我国和日本广泛用于RA的治疗,其安全性和有效性在上市后监测中也得到证实。以前的研究发现,IGU能够抑制大鼠炎症模型中缓激肽的释放,还能抑制RA成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)分泌白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-8。IGU能降低胶原诱导关节炎大鼠血清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-1β和IL-6的水平。IGU在体外条件下还可以抑制B细胞产生Ig。此外,IGU对难治性RA患者有效。但目前,IGU对RA关键致病环节瓜氨酸化的影响并未得到深入研究。目的:探讨IGU是否通过PAD影响CP的产生,并比较IGU和其他RA常用的治疗药物对TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的影响,明确IGU对RA患者外周血白细胞瓜氨酸化的影响及其机制,探讨IGU治疗RA针对的新靶点,为治疗提供新的依据。方法:中性粒细胞和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)取自十名RA患者,这十名患者排除了感染及其他免疫系统疾病,并且在最近一年内仅使用过非甾体类抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)。应用5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的IGU、10nmol/L(nM)和100nM的甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、10μmol/L(μM)和100μM的地塞米松(dexamethasone,DXM)在体外培养这两种细胞8小时,并分别以未加任何药物的细胞做为对照。分别收集中性粒细胞和PBMC培养上清液,并使用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的浓度。分别从两种培养细胞中提取总蛋白,并使用免疫印迹法检测CP、PAD2和PAD4的表达。分别从两种培养细胞中提取总RNA并用其合成cDNA,使用实时定量聚合酶链反应法(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测PAD2和PAD4 mRNA的表达。结果:IGU抑制中性粒细胞中CP和PAD蛋白的表达。在中性粒细胞中,与对照组相比,IGU、MTX和DXM能够抑制CP、PAD2和PAD4的表达(P<0.05),并且抑制作用与药物浓度有关。与对照组相比,10μg/ml和20μg/ml IGU、100nM MTX和100μM DXM的抑制作用有显著统计学差异(P<0.01)。20μg/ml IGU分别使CP、PAD2和PAD4蛋白的相对表达水平降低至对照组的77%、69%和74%;100nM MTX分别使CP、PAD2和PAD4蛋白的相对表达水平降低至对照组的78%、71%和71%;100μM DXM的抑制作用最强(P<0.05),分别使CP、PAD2和PAD4蛋白的相对表达水平降低至对照组的68%、46%和53%,并且20μg/ml IGU和100nM MTX的抑制作用之间比较无统计学差异(P>0.05)。然而,在PBMC中,三种药物使CP、PAD2和PAD4蛋白相对表达水平改变的范围分别为82%至118%、64%至114%和73%至114%,与对照组相比,这些变化均无统计学差异(P>0.05)。IGU抑制中性粒细胞中PAD mRNA的表达。PAD在mRNA水平上的变化与蛋白质水平上的变化相似。在中性粒细胞中,与对照组相比,三种药物能够显著抑制PAD2和PAD4 mRNA的表达(P<0.01),并且抑制作用与药物浓度有关。20μg/ml IGU、100nM MTX和100μM DXM三者的抑制作用之间比较无统计学差异(P>0.05)。在PBMC中,三种药物使PAD2和PAD4 mRNA相对表达水平改变的范围分别为41%至182%和40%至173%,但与对照组相比,这些变化均无统计学差异(P>0.05)。IGU抑制中性粒细胞和PBMC分泌促炎因子,并且抑制作用与药物浓度有关。与对照组相比,三种药物均抑制中性粒细胞和PBMCs分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8,其中20μg/ml IGU、100nM MTX和100μM DXM的抑制作用有显著统计学差异(P<0.01),10μg/ml IGU和10nM MTX也能够抑制中性粒细胞和PBMC分泌上述促炎因子(P<0.05)。除IL-1β外,20μg/ml IGU、100nM MTX和100μM DXM三者抑制促炎因子分泌的作用之间比较,100μM DXM作用最强(P<0.05),但20μg/ml IGU和100nM MTX之间比较无统计学差异(P>0.05)。结论:1.IGU抑制RA患者中性粒细胞中CP的表达,这种抑制作用在特定浓度下与MTX相当。2.IGU在mRNA和蛋白水平抑制RA患者中性粒细胞中PAD的表达,这种抑制作用在特定浓度下与MTX相当。3.IGU降低RA患者中性粒细胞和PBMCs分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的水平,并且抑制作用随浓度升高而增大。