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目的： 结核杆菌热休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）具有载体分子效应和免疫佐剂的生物学功能，将结核杆菌HSP70基因与乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因融合，构建融合乙型肝炎DNA疫苗，并进一步研究融合乙肝DNA疫苗在小鼠体内诱导体液免疫和细胞免疫应答的效果，旨在通过基因融合技术提高乙肝DNA疫苗的免疫效果，并为进一步探索乙肝治疗性疫苗和融合蛋白疫苗打基础。方法：1．HSP70真核表达质粒的构建和鉴定：用PCR的方法从结核杆菌标准株H37Rv 基因组中扩增出HSP70基因，经A-T克隆入质粒pGEM-T vector，构建成重组 质粒pGEM-HSP70，经酶切鉴定和DNA序列测定证实目的基因无误后，亚克 隆到质粒pcDNA3.1（+），构建成真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70。2．HBsAg及其与热休克蛋白70融合表达质粒的构建和鉴定：用PCR方法和基因 克隆技术，构建成重组质粒pCI-S（含HBsAg主蛋白基因全序列）、重组质粒 pCI-HSP70（含HSP70基因全序列）、融合表达质粒拉pCI-S-HSP70（含HBsAg 主蛋白与热休克蛋白70融合基因，即HBsAg基因敲除终止密码后，将其C端 与HSP70基因的N端融合）和融合表达质粒pCI-S-HSP70C（含HBsAg主蛋 白基因与HSP70基因C端约780bp的融合基因），上述质粒分别用酶切和DNA 序列测定鉴定。3．重组质粒pCI-S、pCI-S-HSP70、pCI-S-HSP70C和pCI-HSP70在真核细胞中的 重庆医科大学博士学位论文 表达：重组质粒用脂质体介导的方法转染HepGZ细胞和COSJ细胞，48小时 后，用RT－PCR检测目的基因mANA在转录水平的表达；用免疫细胞化学检测 HBsAg在HopGZ细胞中的表达：用ELISA的方法检测HBsAg在HepGZ细胞 和COS－7细胞培养上清和细胞裂解液中的含量。’．质粒 DNA兔疫 BALB／c小鼠：分 10组，分别注射＾；pCIS 0（）ti，B： PCI－S－HSP70 100ug，C： PCI－HSP70 100fig，D：PCI－S－HSP70C 100fig，E：PCI－S 5肋g十沁1－＊SP7o 50Ug，F：p＊1－s 50＊g巾＊1－｝＊S＊7o 50＊g，0：p＊1－s 50吧 巾＊1－＊＊8P70C soUg，H：乙肝疫苗IUg，1：＊1一10oUg，J：P8s 10＊。免 疫4周后，用ELISA检测小鼠血清中抗－HBS水平。4天后，予相同剂量的质 粒DNA加强免疫一次，加强免疫4周后，处死小鼠，用ELISA检测小鼠血清 中抗－HBS水平：用乳酸脱氢酶释放法检测小鼠脾细胞HBSAg特异性CTL活性； 并于体外用HBSAg刺激小鼠脾细胞，用ELISA检测小鼠脾细胞IL工、IFN－Y 和IL叶的分泌水平。结果：1．重组质粒的鉴定：经酶切鉴定或DNA序列测定证实重组质粒pCI习巾CIHSP70、 pCI－S－HSP70和pCI－S－HSP70C构建正确。2．重组质粒在真核细胞中的表达：（）分别用重组质粒pCIS、pCI毛nSP70、 pCIS－HSP70C和pCI－HSP70转染HopGZ 细胞，48八时后，用RT－PCR检测细 胞总RNA中目的基因mRNA的表达，结果均为阳性，说明在转录水平有目的 基因表达。（2）分别用重组质粒吓I－S、pCI－S－HSP70、pCI－S－HSP70C和对照 质粒PCIHSP70、PCI1eo转染HepGZ细胞，48 ，J＼时后，用免疫细胞化学的方 法检测HBSAg，结果发现重组质粒扯－S、pCI－S－HSP70、pCIS－HSP70C转染 的HepGZ细胞在胞浆和核周有大量棕褐色的阳性颗粒，细胞核为深褐色，说明 PCI－S、PCIS－HSP70和PCI－S－HSP70C在HepGZ 细胞中有相应的蛋白表达；质 粒 pCI－HSP70、pCI－neo转染的 HepGZ 细胞为阴性。（3）分别用重组质粒 pCIS、 pCI－S－HSP70、pCI－S－HSP70C和对照质粒pCI－HSP70、pCI－neo转染HepGZ 细 4 重庆医科大学博士学位论文 胞和COS－7细胞，48小时后，用ELISA检测细胞培养上清及细胞裂解液中 HBsAg，质粒pCIS在HopGZ细胞和COSJ细胞的培养上清及细胞裂解液中 均为阳性，而pCIS－HSP70和pCIS－HSP70C仅在细胞裂解液中检测到HBSAg 为阳性，细胞培养上清为阴性，说明S基因与HSP70或HSP70C基因融合之后， 表达的融合蛋白不分泌到胞外。对照质粒pCI羽SP70、pCI心eo转染的细胞培 养上清及细胞裂解液均为阴性。 3．质粒DNA免疫小鼠体液免疫检测结果：门)初次免疫4周后，PCI七、 pCI－S－HSP70、pCI、S－HSP70C、pCI－S＋pCI－HSP70，pCI－S ＋pCI－S－HSP70、 pCIS＋pCI－S－HSP70C和乙肝疫苗组小鼠均检测至抗－HBS阳性，而以 pCI－S和 乙肝疫苗组抗－HBs的滴度最高，P／N值分别为 10．88和 10．40，对照组 pCI－HSP70、pClllCO和PBS为阴性；（二）力强免疫4周后，pCI－S、pCI－S＋ pCIS－HSP70和乙肝疫苗组小鼠抗－HBS滴度显著升高，PM值分别