类外泌体纳米囊泡与外泌体在提高脂肪移植存活率的比较研究

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目的:目前,自体脂肪移植在整形美容外科发挥着日益重要的作用,不仅被广泛应用于面部年轻化等美容外科,同时,因其具有操作简便、创伤小、恢复快、易于推广、生物相容性好、来源丰富、填充效果好等显著优势,也被逐渐应用于填充组织凹陷等组织器官修复重建领域。然而,传统单纯脂肪采集及注射技术存在着高吸收率、低存活率等不足,特别在大范围体表组织缺损重建等需要较大量脂肪移植时,自体脂肪移植技术的不足又限制了其进一步应用和推广。为了更好推广自体脂肪移植技术在整形美容领域的应用,已经有许多方法被提出来用来提高脂肪移植物的存活率。其中干细胞在脂肪移植领域的再生作用得到多个研究的验证。但是,干细胞增殖分化调控机制尚未完全明确、存在转化为肿瘤细胞的风险,并且近来研究显示脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)主要通过旁分泌途径发挥作用。ADSCs可通过分泌外泌体(exosomes,EXOs)的方式携带可溶性因子,执行生物学功能。但细胞释放的EXOs数量非常少,且获取过程繁琐。克服这一缺点的一种策略是大规模制备细胞来源的纳米级囊泡。(exosome-mimetic nanovesicles,NVs)。本研究旨在对比人工制备纳米级NVs与EXOs在提高脂肪移植存活率效果的比较研究。方法:1.利用水动力抽脂方式获取人源性脂肪组织,通过酶解分离提取P4代hADSCs。行成脂成骨分化诱导和流式细胞鉴定。2.提取P4代hADSCs衍生的NVs和EXOs。利用电镜、NTA、纳米流式和zeta进行NVs和EXOs的形态、粒径大小、表面蛋白标记和zeta电位鉴定和比较。3.体外细胞实验:荧光标记NVs和EXOs,动态追踪NVs和EXOs内化到人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的过程。设置不同浓度梯度的NVs和EXOs,研究它们促进HUVECs增殖、迁移、血管形成的最适浓度。4.动物实验:创建裸鼠脂肪移植模型,以体外实验结果获得的最适浓度的NVs和EXOs分别与等量的水动力抽脂获得的脂肪组织混合,移植到裸鼠皮下。观察1、2、3月后处死裸鼠取出移植组织,进行体积及重量的称量对比,继而进行切片后H&E染色镜下观察移植组织内细胞形态完整性、空泡形成和纤维化表现;免疫组织化学染色(CD34、VEGF、Ki67)观察新生血管生成、增殖情况。结果:1.光学显微镜可见hADSCs呈细长纺锤状特征形态。油红O染色结果显示细胞中有大小不一的红色脂肪滴,茜素红染色可见特征性的大量红色着色区。hADSCs表面标记物表达CD29+/CD34+/CD90+/CD31-/CD45-。2.电镜结果显示NVs和EXOs均为球形双层膜结构,NTA粒径范围约为50-150nm,纳米流式分析CD9和CD81表达阳性,zeta电位为负值。3.体外实验我们发现NVs和EXOs在低浓度时,随浓度增高其促进HUVECs的增殖、迁移、血管形成能力越显著,当达到最适浓度后,继续增加浓度效果反而下降。NVs的最适浓度为60ug/m L,EXOs的最适浓度为40ug/m L。4.体内实验验证了NVs和EXOs能够有效提高脂肪移植存活率。且NVs和EXOs提高脂肪移植存活的机制主要与其促进新生血管形成有关。结论:NVs的形态、大小、膜结构与EXOs相似。在脂肪移植领域可以达到跟EXOs相当的效果。同时NVs产量高远远高于EXOs。因此,其有望替代EXOs用于脂肪移植领域,且对其他再生医学领域提供新的思路。
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