第一部分骨髓间充质干细胞迁移至小鼠长干骨骨折部位促进骨折愈合过程中迁移及修复的研究一、目的：本研究在建立小鼠股骨闭合型骨折模型的基础上，观察骨折后干细胞向骨折断端归巢的现象，研究干细胞归巢后的转归及作用机制；观察骨折后不同时间点注射间充质干细胞对骨折愈合的影响，为注射干细胞修复骨折提供临床应用参考。二、方法：1、设计制作设备，建立小鼠股骨闭合型骨折内固定模型。2、使用PCR方法检测小鼠骨折后趋化因子的表达时间变化。3、建立Transwell细胞迁移模型，检验骨折组织匀浆对骨髓间充质干细胞迁移的趋化作用，使用SDF-1/CXCR4轴特异性阻断剂AMD3100检验SDF-1的促迁移作用。4、建立小鼠股骨闭合骨折内固定模型，经尾静脉注射表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，使用荧光成像技术、冰冻切片及病理学方法观察骨髓间充质干细胞是否通过机体血液循环归巢至骨折端，应用免疫荧光和Western-blot检测方法检查骨髓间充质干细胞的转归，应用SDF-1的受体CXCR4的特异性阻断剂AMD3100进一步验证SDF-1/CXCR4通路对骨髓间充质干细胞归巢的动员机制。5、通过不同时间点向小鼠股骨闭合骨折内固定模型行尾静脉注射表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，使用荧光成像方法、Micro-CT、生物力学检测寻找注射外源性骨髓间充质干细胞促骨折愈合的最佳时间点。三、结果：1、成功自制闭合型骨折制备器，建立可靠的小鼠股骨闭合型骨折内固定模型。2、小鼠骨折后0，3，7，14，28d骨折端组织提取物的趋化因子SDF-1和MCP-3的mRNA表达均在7d达高峰， TGF-β1也在7天开始升高。3、小鼠骨折后7d骨折断端的组织匀浆可以在体外Transwell模型中促进骨髓间充质干细胞的迁移，该趋化作用可以被AMD3100阻断。4、小鼠骨折后7d尾静脉注射表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞向骨折端局部迁移，42d后仍能观察到荧光细胞表达。骨髓间充质干细胞归巢到骨折端骨内膜处，表达成骨相关因子OPN，OCN及趋化因子SDF-1。并促进成骨相关因子BMP2，TGF-β1及VEGF的表达。术后14d及42d标本取材固定后HE染色及Masson三色染色显示骨折愈合明显增快增强。骨折端组织对BMSCs的趋化作用，可以被SDF-1/CXCR4轴阻断剂AMD3100阻断。5、术后7d在小鼠股骨闭合骨折内固定模型行尾静脉注射表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，荧光成像光密度值、BMD，BV，BVF，最大载荷，最大桡度，弹性桡度和刚度等指标均优于术后1d或14d。四、结论：1、自主研制的骨折制备器可成功模拟小鼠闭合性股骨固定。并行髓内固定。观察骨折愈合全过程，符合骨折软骨内成骨愈合进程。2、骨折端组织在第7d时主要趋化因子的表达都在高值。支持术后7d注射骨髓间充质干细胞为最佳注射时机。3、Transwell细胞侵袭试验说明SDF-1/CXCR4通路在促细胞迁移方面起到重要作用。4、系统注射间充质干细胞迁移至骨折断端骨内膜处并长时间增殖表达，自身表达促成骨因子，也促进旁分泌成骨因子，明显促进骨折愈合。 SDF-1/CXCR4通路在其中起到重要作用。5、骨折术后7d注射间充质干细胞较术后1d及14d为促进骨折愈合最佳注射时机。第二部分间充质干细胞在软骨损伤中迁移现象及机制的研究一、目的：研究软骨损伤后骨髓间充质干细胞向软骨下骨下归巢的现象及其可能机制。二、方法：1、制作大鼠股骨滑车直径2mm，深1mm骨软骨缺损模型。2、术后向关节腔注射106/0.2ml表达红色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞。3、术后1、2、3、7d股骨髁取材，行冰冻切片，Hochest33258染色后在荧光显微镜下观测，观察骨髓间充质干细胞分布。4、术后3、7、14、21d，取骨髓间充质干细胞注射组及生理盐水注射组关节囊内滑膜及髌下脂肪垫组织行蛋白芯片检测。取股骨髁间软骨缺损周围4×4×2mm范围骨软骨组织，立即液氮下研磨后提取RNA行RT-PCR检测趋化因子。5、术后3m，待缺损纤维愈合后再次注射106/0.2ml骨髓间充质干细胞。术后1、2、3、7d股骨髁取材，行冰冻切片，Hochest33258染色后在荧光显微镜下观测，观察骨髓间充质干细胞分布。三、结果：1、缺损术后并注射RFP-BMSCs后1、2d，BMSC出现在软骨缺损区。3d后进入软骨下骨下骨髓腔，软骨缺损区保留少。2、缺损术后3m，缺损区纤维修复再次注射RFP-BMSC后7d内未见到RFP-BMSC迁移到缺损区及软骨下骨区。3、缺损术后并注射骨髓间充质干细胞组3、7d关节囊内滑膜及髌下脂肪组织内炎症因子表达均高于未干预组。干细胞注射组软骨缺损区周围趋化因子表达也高于未干预组。四、结论：大鼠股骨髁软骨全层缺损后注射骨髓间充质干细胞可能增加关节腔滑膜组织的炎症因子的分泌，因软骨下骨内趋化因子表达增高从而促使骨髓间充质干细胞向软骨下骨下骨髓内迁移。