论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病，给养猪业带来了巨大的经济损失。本研究利用反向遗传学操作技术，构建了PRRSV BJ-4株的全长cDNA克隆，并对全长cDNA克隆中存在的23个突变位点进行了回复突变，继而对突变后的全长cDNA克隆体外转录体的感染性进行了研究。为将来实现在DNA水平上对PRRSV基因组的人工操作，从而在分子水平上研究PRRSV的复制和致病机理、基因产物的功能等提供技术手段，并为构建新型的病毒载体和发展安全有效的活病毒疫苗奠定基础。 依据PRRSV BJ-4株全基因组序列，分6段设计引物，覆盖PRRSV基因组的cDNA重叠片段A1、A2、B1、B2、C和D的预期大小分别为1,294bp、3,452bp、3,376bp、1,823bp、3,484bp和2,887bp。通过优化RT-PCR反应条件，最终扩增出其全基因组cDNA片段。并将它们分别克隆入pGEM-T Easy载体或pBluescript SK+载体。然后将获得的6个克隆依次连接并克隆到低拷贝质粒载体pWSK29中，获得该毒株全长cDNA克隆pWSK DCBA。在全长cDNA克隆的两端和中间引入了病毒序列中不存在的单酶切位点，并在序列的5′端引入了SP6 RNA聚合酶启动子序列以及一个外源的“G”，在3′端引入了poly（T）83序列。 对扩增出的覆盖PRRSV全基因组cDNA的6个片段分别进行序列测定，并与其原始病毒BJ-4株以及其它GenBank中已有的PRRSV序列进行比对，发现其中存在23个碱基的变异。用定向点突变方法，对这些碱基进行了回复突变，得到包含PRRSV各cDNA重叠片段的6个克隆，经序列测定证实，这6个克隆在成功恢复23个变异碱基的同时，未引入新的突变。将它们依次连接并克隆到低拷贝质粒载体pWSK29中，获得了该毒株定点突变后的全长cDNA克隆P1P2mP3P4-63。 将病毒的全长cDNA克隆P1P2mP3P4-63大量培养后，按低拷贝质粒提取方法提取质粒，用限制性内切酶Sph Ⅰ酶切线性化后，作为体外转录模板。转录出的RNA用DNase Ⅰ消化模板质粒DNA，再经脂质体DMRIE-C转染BHK-21细胞，转染后24h的培养上清接种Marc-145细胞后，连续培养3代，在传至第2代时能产生典型的细胞病变。经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定，证实获得了有感染性的恢复病毒，表明成功地构建出了具有感染性的PRRSV全长cDNA克隆。