目的:原发性肺癌是全球范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤,是威胁人类健康的重要杀手之一。美国疾病控制与预防中心联合美国癌症协会等机构联合共同发布的《国家癌症数据年度报告》中指出:2020年美国男性和女性肺癌新增病例数仅次于前列腺癌及乳腺癌,位列第2位,死亡率则高居第一位,几乎占到了癌症总死亡率的四分之一。2020年世界卫生组织公布的全球肺癌相关数据表明,全球肺癌新发病人数约210万,死亡人数约180万。我国也是肺癌高发地区,肺癌位居我国所有恶性肿瘤中发病率第一位。在死亡率方面,肺癌也同样位居我国恶性肿瘤死亡第一位。随着人们健康意识水平的提高,肺癌筛查工作的广泛开展,针对肺癌治疗的手段不断改进,例如分子靶向治疗,免疫治疗等,尽管肺癌的总体死亡率呈现下降趋势,但5年总体生存率仍比较低,临床治疗获益仍然很有限,手术后的复发,治疗后的复发和耐药,仍然是困扰临床医生的重要问题。KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1）编码于KEAP1基因,1999年,由日本科学家等通过酵母双杂交试验筛选,从NRF2中分离出一种富含巯基的蛋白质负调控因子,对亲电敏感,是氧化剂的细胞内传感器,NRF2/KEAP1轴被公认为调节细胞稳态的至关重要的调节器之一。目前有关KEAP1在乳腺癌、肺癌、胆囊癌、肝癌、子宫内膜癌等癌症领域有一定的研究,更多的研究集中在KEAP1/NRF2轴对癌症的影响,但对KEAP1的关注很少超出其与NRF2关联之外的情况。KEAP1在肺癌的发生发展中发挥什么样的作用,目前并不是完全清楚,也没有明确的定论。癌症目前被广泛地认为是一种代谢性疾病,代谢重编程是癌症的一个重要特征。癌症代谢部分是通过致癌基因和肿瘤抑制基因突变激活的信号和转录网络来调控的,从而在遗传多样性的癌症细胞中产生异质性的细胞自主表型,特定的代谢活动可以通过干扰致癌信号通路中关键酶的活性,导致癌细胞代谢重编程,直接参与支持使肿瘤生长的生物过程。研究初期利用生物信息学技术发现KEAP1表达的高低与临床预后密切相关,并在预实验阶段发现,KEAP1在肺癌组织标本中的表达情况明显低于癌旁组织,初步判断KEAP1似乎是抑癌基因,但组织标本中KEAP1/NRF2的变化与细胞中的表达情况并不相一致,NRF2在癌症中可以引起代谢重编程,但目前没有明确的研究表明KEAP1会直接影响肺癌的代谢通路,KEAP1在肺癌组织中的这种规律性变化也绝非偶然,所以本研究的主要目的是探讨KEAP1对非小细胞肺癌增殖方面的影响以及利用代谢组学分析KEAP1影响非小细胞肺癌代谢的分子机制。明确KEAP1在临床科研方面的应用价值。研究方法:1、通过生物信息学从转录水平及蛋白水平分析KEAP1基因在肺癌及癌旁组织中的表达情况并对临床预后生存率进行统计学分析。通过富集通路分析,预测与肺腺癌及肺鳞癌密切相关的代谢通路。收集辽宁省肿瘤医院胸外科行手术治疗的34例肺癌患者的组织标本,所有患者均未接受术前抗肿瘤治疗。利用Western blot验证KEAP1在癌组织与癌旁组织的表达差异,进一步对照生物信息学分析结果,进行相互验证。2、培养人非小细胞肺癌细胞株A549、H1299、H460和H2030,通过慢病毒介导的RNA干扰技术敲低KEAP1基因表达,通过MTT、结晶紫染色、CCK8试验、检测KEAP1对非小细胞肺癌细胞系增殖的影响;利用划痕试验检测其对细胞迁移的影响。3、利用CE-MS（毛细管电泳质谱联用）和LC-MS（液相色谱质谱联用）技术对辽宁省肿瘤医院提供的34对非小细胞肺癌及癌旁配对标本进行代谢组学分析,同时利用CE-MS对KEAP1敲低的H1299细胞系进行代谢组学分析,对比组织标本及细胞系的代谢产物,寻找共同的代谢产物,分析代谢途径及可能相关的肿瘤信号通路;4、根据代谢组学的结果,通过免疫印迹和QRT-PCR（实时定量PCR）技术对氨基酸稳态影响的m TOR信号通路的相关蛋白S6、m TOR、Rag D进行相应的验证,明确KEAP1与m TOR信号通路之间的相关性。结果:1、通过CPTAC数据库从蛋白水平进行KEAP1基因表达谱分析,结果显示KEAP1在肺腺癌组织中基因表达量显著低于癌旁组织,表达差异有统计学意义（p＜0.05）。通过GEO数据库利用R语言提取数据进行转录组水平分析KEAP1与非小细胞肺癌临床预后相关性分析,发现KEAP1高表达组的生存率明显由于低表达组,有显著统计学差异（p=0.029）;KEGG通路富集分析发现KEAP1在LUAD和LUSC中均与代谢相关信号通路显著相关。2、对34对非小细胞肺癌的癌与癌旁组织进行免疫印迹实验,结果发现,KEAP1在肺癌组织中表达低于癌旁组织,具有显著的统计学差异（p＜0.05）;在H460、H1299细胞系中干扰KEAP1基因表达后并未显著改变肺癌细胞的增殖能力,过表达KEAP1肺癌细胞增殖也没有明显受到抑制,干扰KEAP1对肺癌细胞的迁移能力未见明显影响。3、34对非小细胞肺癌的癌与癌旁组织进行代谢组学分析,总共检测到253个代谢产物,进行PLS-DA分析以呈现样品间代谢特征的差异,通过PCA得分图显示:癌旁组织和癌组织存在显著的差异性,R2X=0.578,Q2=0.353。使用Me V软件进行热图的绘制,发现当癌旁组织的部分代谢物下调时,癌组织相对应的代谢物上调,而当癌旁组织的其它代谢物上调时,癌组织相对应的代谢物又发生下调,并且存在明显的差异趋势,部分代谢产物的变化与病理类型有一定的相关性。汇总代谢产物的数据于Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca）网站上进行差异代谢物的通路富集分析发现,KEAP1下调在34对肺癌组织标本中所诱发的代谢产物的变化与甘氨酸与丝氨酸、谷氨酸、蛋氨酸等氨基酸代谢通路存在一定的相关性,另外还与Warburg效应、尿素循环等代谢通路密切相关。4、对KEAP1敲低H1299细胞系进行代谢组学分析。总共检测到108个代谢产物,同样利用Me V软件对代谢产物数据进行汇总,绘制热图,结果发现,相比于对照组,在KEAP1敲低情况下,其中的部分代谢物发生了显著的变化,例如,KEAP1敲低组中丝氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸等氨基酸明显下调,而NADH、FAD、Co A、GSH、牛磺酸等代谢物明显上调。汇总代谢产物的数据于Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca）网站上进行差异代谢物的通路富集分析发现,KEAP1敲低诱发的代谢产物的改变与氨基酸的生物合成、癌症中心碳代谢、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢、精氨酸代谢与合成、脯氨酸代谢、蛋白的消化与吸收有一定的相关性。5、非小细胞肺癌组织与细胞系共同改变趋势的代谢产物为氨基酸,氨基酸呈下调趋势。利用KEAP1敲低H1299细胞系对氨基酸所影响的m TOR信号通路进行免疫印迹检测,发现干扰KEAP1后m TOR、S6的磷酸化水平明显降低,通过q PCR检测m TOR的激活剂Rag D,干扰KEAP1后Rag D的RNA水平下调。结论:1、非小细胞肺癌中,KEAP1的表达情况与临床预后密切相关,KEAP1高表达的生存率显著优于低表达的生存率;2、敲低KEAP1会引起非小细胞肺癌代谢重编程,且不依赖NRF2,其中以氨基酸下调最为显著;3、敲低KEAP1所诱导的氨基酸代谢重编程与m TOR信号通路密切相关,其方式可能通过Rag D进行调节。