H5N1亚型高致病性禽流感在中国、越南、印度尼西亚、印度、孟加拉国和埃及呈地方流行性,给养禽业带来了巨大的经济损失。人可感染H5N1亚型高致病性禽流感,虽然目前还没有发现H5N1亚型AIV具有人传人的能力,但它们有可能通过抗原变异或病毒重配方式获得人传人的能力,对人类存在巨大的潜在威胁性。因此高致病H5亚型AIV是非常重要的人兽共患病。血凝素蛋白(HA)是流感病毒表面主要的保护性抗原,它在合成时通常都经过糖基化修饰的过程。随着H5N1禽流感病毒迅速进化,新的变异clade病毒不断出现,HA蛋白表面糖基化位点模式日益复杂化。本研究以AIV A/Mallard/Huadong/S/2005 (H5N1, Clade 2.3.4)为模型,利用点突变方法在HA蛋白表面添加或删除糖基化位点,从而构建了HA蛋白上含不同糖基化位点模式的突变病毒,以研究HA蛋白糖基化位点对AIV生物学特性、致病性和抗原性的影响。1.H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白头部糖基化位点突变株的构建及生物学特性研究以SY株为母本病毒,利用反向遗传技术在HA蛋白头部添加或删除糖基化位点(144、158和169位),从而构建了HA蛋白上含不同糖基化位点模式的突变病毒,并测定了各重组AIV的生物学特性。结果显示,去除158位糖基化位点不但可以显著增强HA蛋白与唾液酸受体的亲和力,还可以让H5N1亚型AIV具备a2,6唾液酸受体的结合能力,而在HA蛋白头部保留144位和169位糖基化位点同时去除158位糖基化位点时,AIV结合a2,6唾液酸受体的能力最强。在MDCK细胞上,单独缺失HA蛋白158位或169位糖基化位点对AIV体外复制起抑制作用,表现为空斑直径减小。在158位糖基化位点存在的前提下,添加144位糖基化位点可增强AIV体外复制能力,表现为空斑直径增大。各重组病毒在CEF细胞上的复制能力无明显差异。综上所述,HA蛋白头部糖基化位点可影响AIV受体结合和体外复制能力。2.HA蛋白头部糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒哺乳动物致病性的影响将各重组病毒以鼻内接种途径感染6周龄BALB/c小鼠,感染剂量分别为104EID50和106EIDso。在104 EID50攻毒剂量下,突变病毒rSˇ144+/158-/169-和rS-144+/158-/169+以及野生型病毒感染组小鼠平均体重下降轻微(-10%),其他病毒感染组小鼠平均体重下降剧烈(>20%)。此外,在突变病毒rS-144-/158-/169+和rSˇ144-/158+/169-感染组内,所有动物在感染后9天内死亡。另一方面,当攻毒剂量为106EIDso时,所有感染动物全部死亡。用104 EID50的剂量感染各重组病毒,分别在感染后3天和6天采集各小鼠脏器,滴定其中病毒滴度,以评价各重组病毒组织扩散能力。结果发现,在感染3天和6天时,所有感染动物肺脏中都能检测到病毒。单缺失158位或169位糖基化位点的流感病毒呈全身性感染,各组织脏器中病毒滴度均达到较高水平。而野生型病毒的感染只局限在小鼠肺脏中。另外,这两株单缺失病毒感染小鼠后,可在其肺脏中诱导高水平的细胞因子,与野生型病毒感染组存在显著性差异。因此,单独缺失HA蛋白158位或169位糖基化位点,可增强病毒的毒力及组织扩散能力,并且诱导高水平的炎性因子。3.HA蛋白头部糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒抗原性的影响为了评价糖基化修饰对流感病毒抗原性的影响,我们制备了各重组病毒高免血清,并测定了各组血清与不同clade流感病毒的交叉反应性。结果发现,相比于野生型病毒抗血清,rS-144-/158+/169-组抗血清具有良好的交叉中和能力。因此,我们选择其作为疫苗候选株进一步评价了其攻毒保护情况。结果发现,当以致死量的SY, DT和ZJ株流感病毒攻毒时,两疫苗组均可提供完全保护(100%)；而当以致死量的WX株流感病毒攻毒时,两免疫组均提供70%的保护。另外,rS-144-/158+/169-免疫鸡在攻毒后,排毒率低于野生型病毒疫苗免疫组,且在DT株流感病毒攻毒后7天时尤其明显。因此,rS-144-/158+/169-免疫后可产较好的交叉中和抗体,抑制病毒排毒的能力优于野生型病毒。4.HA蛋白头部糖基化修饰对H5N1亚型禽流感病毒诱导细胞因子的影响选择A549细胞为体外感染模型,进一步分析了野生型病毒及两株单缺失病毒诱导细胞因子的能力差异。结果表明,与野生型病毒相比,缺失株rS△169在A549细胞上的增殖能力无明显差异,而缺失株rSA158在A549细胞上的增殖能力略有提高,但差异不显著。两突变病毒感染后6h均可检测到IFN-β表达水平上调,且显著高于野生型病毒,与其相关的还有干扰素诱导蛋白(CXCL10)的上调。CCL2的差异性表达较晚,发生在感染后24 h,而IL-8的差异性表达较早,出现在感染后6 h。另外,IL6和TNF-α均能显示差异性表达。进一步研究发现,病毒感染A549后,NF-κB炎症通路被激活,但不同病毒激活通路的程度有差异,突变病毒rSA 158激活通路的能力最强,而突变病毒rS△169激活通路的能力与野生型病毒相当。3株流感病毒感染均可干扰IFN-α诱导的STAT1的磷酸化作用,而对IFN-y诱导的STAT1的磷酸化作用无显著影响。因此,HA蛋白158位糖基化位点缺失病毒诱导细胞因子上调与NF-κB通路激活有关。5.H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白茎部糖基化位点突变株的构建及生物学特性研究采用点突变和反向遗传的方法构建了HA蛋白茎部含不同糖基化位点(11位、23位和286位)的H5N1亚型AIVs,并测定了各重组病毒的生物学特性。研究结果表明,所有组合的HA蛋白糖基化位点缺失重组AIV均可成功拯救,由此可见HA蛋白茎部糖基化位点的缺失不影响感染性子代病毒的产生。缺失11位糖基化位点可降低HA蛋白的裂解效率,如同时缺失23位或286位糖基化位点时,HA蛋白的裂解则被完全阻断,这两株茎部糖基化双缺失病毒在MDCK和CEF细胞上的复制能力显著降低。此外,茎部糖基化位点的缺失可使流感病毒热稳定性和pH稳定性下降,尤其是11位糖基化位点的缺失。因此,茎部11位糖基化位点对HA蛋白裂解和结构稳定起关键作用。