植物的衰老是被植物内部诸多因素所控制,并与所受外部因素影响相结合的一种渐行性衰退过程。衰老机制的探索,可以提高景观植物的观赏价值和作物的产量品质,对保护濒危物种和有文物价值的名木古树也有一定的作用,所以说,衰老机制的研究,不仅具有重要的发育生物学意义,而且具有一定的社会和经济效益。叶是主要的光合器官,积累有大量的营养,对光合阶段积累的营养物质选择再利用,对植物的健康至关重要。衰老叶片的细胞结构改变中显著特点就是细胞内细胞器的瓦解,最早的结构变化是叶绿体中基粒结构及含量的改变。叶绿素荧光是叶绿素分子从激发态变回基态过程中释放的荧光。叶绿体中基粒结构和含量的改变或者任何光合作用的异常,都会造成叶绿素荧光参数的改变。由于衰老叶片中最早的结构改变出现在基粒,所以,以叶绿素荧光参数为指标,可以筛选潜在的衰老相关突变体。本实验室设计以下实验,通过EMS化学诱变拟南芥Col-0的野生型,构建足够量的突变体库,将突变体正常培养,在萌发10 d和25 d的时候,通过叶绿素荧光快速成像系统对突变体进行检测,筛选得到叶绿素荧光参数Fv/Fm有异常的突变体。本实验以其中一株叶绿素荧光参数Fv/Fm衰减且可以稳定遗传的突变体E61为实验材料,经两轮的“回交--自交--筛选”,获得背景纯净的突变体E61,后续遗传分析确定E61突变体为单基因隐形突变,运用定位克隆技术定位该突变基因在一号染色体下游SSLP分子标记T9L24附近,通过DNA测序得到了该突变基因为AT1G73470,该基因的413位碱基由G诱变为A,编码的氨基酸由精氨酸(CGC)变为了组氨酸(CAC)。成功克隆该突变基因以后,构建该基因的回补、超表达、组织定位及亚细胞定位载体,通过农杆菌花序浸染获得相应的拟南芥转基因植株。经过回补实验进行验证,发现突变体的叶绿素荧光参数Fv/Fm衰减的表型,确实是由AT1G73470基因的突变造成的。通过GUS染料对材料进行组织定位,结果表明,该基因在拟南芥生长期的叶片中进行表达,在根、花以及衰老的叶片中均无表达。构建的目的基因与GFP融合表达载体,通过瞬转,转入拟南芥叶肉细胞的原生质体中,通过激光共聚焦电子显微镜观察,可见目的蛋白和GFP的融合蛋白以散点状均匀分布在叶肉细胞内;用线粒体黄色荧光染料对上述原生质体进行染色,发现目的基因的绿色荧光与线粒体的黄色荧光并未重合,该基因并非在线粒体上表达,具体的亚细胞定位还需进一步确定。在生理生化方面,发现E61种子的萌发对ABA具有一定的耐受性,E61的长势较WT缓慢,花期、衰老都迟于WT,生长周期长于WT;E61的叶绿素含量高于WT,可溶性糖略低于WT,MDA含量略高于WT,暗处理诱导衰老发现E61的叶绿素降解速度要快于WT。综上,突变体E61的叶绿素荧光衰减表型是由基因AT1G73470突变造成的,该基因参与了植物叶绿素讲解过程,影响了植物的开花、衰老等生长过程。