土壤盐渍化和干旱沙质化是造成农作物减产的两大全球性非生物胁迫因素。当植物遭受到高盐、干旱和极端温度等非生物胁迫时,植物体内原有的代谢调控系统被打破,以响应胁迫因素引起的信号变化。WRKY转录因子在植物信号网络重建和调控方面起着重要作用,一方面可以协调不同信号通路以重建新的代谢网络,另一方面可以感知胁迫信号而调控抗逆基因的表达,以帮助植物适应外界不利因素的影响。然而,WRKY基因的功能研究主要集中于生物胁迫反应中,对非生物胁迫的研究还处于起始阶段。红麻(HHibiscus cannabinus)作为一种重要的环境友好型能源作物,本身具有一定的抗逆性,但是对其WRKY基因的研究却鲜有报道。此外,当植物遭受胁迫时,其体内稳定表达的管家基因也会响应胁迫信号而发生表达变化,而管家基因的不稳定表达会直接影响靶基因的表达水平。因此,本研究首先通过qRT-PCR 方法和 geNorm,NormFinder 和 BestKeeper 软件对不同胁迫条件下黄/红麻内参基因的稳定性进行了评估,获得适合于胁迫条件下稳定表达的内参基因,然后对红麻28个WRKY基因进行了不同组织和不同胁迫条件下的表达分析,筛选得到2个积极响应盐和干旱胁迫的红麻WRKY基因HcWRKY17和HcWRKY26,最后对这两个基因的功能进行了系统研究。主要的研究结果和结论为:1、获得了非生物胁迫条件下稳定表达的黄/红麻内参基因本研究通过 qRT-PCR 方法和 geNorm,NormFinder 和 BestKeeper软件对黄/红麻内参基因在不同胁迫(高盐、干旱和低温)处理和不同组织中的表达稳定性进行了分析评估,得到适合于黄/红麻不同胁迫条件下稳定表达的内参基因。结果表明,适合黄麻盐胁迫条件下稳定表达的内参基因为ACT7和RAV;适合黄麻干旱胁迫下的内参基因为DnaJ和UBC;适合黄麻生物胁迫条件下的内参基因为ACT7和RAN;适合黄麻不同组织样品中的内参基因为UBI和TUB。而适合红麻盐、干旱和低温胁迫条件下的最佳内参基因为PP2A和PTB;适合红麻不同激素刺激下的内参基因为ACT4和PP2A;适合红麻不同组织样品中的内参基因为EF1α、PTB和18S rRNA。该研究结果可以为黄/红麻功能基因的表达研究提供重要的参考依据。2、红麻Hc 基因的表达具有组织特异性并且受非生物胁迫和激素的诱导将28个红麻HcWRKY基因在不同组织器官中进行qRT-PCR表达分析,结果表明,在不同的组织中28个红麻Hc WRKY基因的表达丰度不同。其中,HcWRKY13、HcWRKY8和HcWRKY6在根、茎、叶和韧皮部中表达量较高;Hc WRKY23和HcWRKY28在根、茎和叶中表达量较高;HcWRKY17在根、茎和韧皮部中表达量较高;HcWRKY5和HcWRKY27在茎、叶和韧皮部中表达量较高;HcWRKY24和Hc WRKY25在根中表达量较高;而Hc WRKY9、HcWRKY14和HcWRKY18 基因在叶中表达量较高。对28个HcWRKY基因进行不同胁迫条件下的qRT-PCR表达分析,结果表明,这28个HcWRKY基因可以受盐碱、干旱和低温等非生物及激素ABA、JA、SA和ET等的诱导。其中,5个基因(HcWRKY15、HcWRKY17、HcWYRK19、HcWRKY23和HcWRKY26)可以同时响应高盐、干旱和低温等非生物胁迫的诱导;2个基因(HcWRKY8和HcWRKY15)受ABA诱导上调;9个基因(HHcWRKY3、HcWRKY8、HcWRKY13、HcWRKY15、HcWRKY17、HcWRKY19、HcWRKY20、HcWRKY22和HcWRKY26)受JA诱导;2个基因(HcWRKY14和HcWRKY24受SA诱导;而植株受到乙烯作用后,只有基因HcWRKY13和HcWRKY22受诱导上调表达。通过不同条件下的表达谱分析,进一步对28个HcWRKY进行划分归类,为后续明确红麻HcWRKY基因的功能研究奠定了基础。3、Hc WRKY17调节渗透胁迫,调控ABA诱导的气孔闭合在受到盐和干旱胁迫后,HcWRKY17的转录表达水平显著提高。亚细胞定位分析表明HcWRKY17蛋白在细胞核内发挥作用。过表达HcWRKY17株系在平板处理和土培处理条件下均表现出对盐和干旱的抗逆性。具体表现为过表达植株的MDA含量较低,离子导电率较低,细胞膜渗透保护物质脯氨酸合成关键酶基因P5CS的表达上调以及气孔密度减小等。在盐胁迫条件下HcWRKY17过表达株系的种子萌发受到抑制,而种子的萌发和萌发后的生长对ABA不敏感。通过基因表达分析发现,在过表达株系中ABA响应因子ABI5和ABF4的表达量降低,而其功能拮抗因子ABI1和ABI2的表达量升高。说明HcWRKY17参与ABA信号途径进而调节种子萌发。此外,过表达HcWRKY17株系的叶片单位面积气孔数目明显少于野生型,而气孔大小却没有发生改变,而且过表达HcWRKY17株系的气孔关闭对ABA较野生型敏感,说明HcWRKY17可以促进ABA介导的气孔闭合。以上结果表明,HcWRKY17蛋白参与ABA信号途径进而调节胁迫条件下种子的萌发和气孔闭合度以帮助植物度过或适应外界不利条件的影响。4、HcWRKY26在应答盐和干旱胁迫过程中起负调控作用尽管HcWRKY26也能积极响应盐和干旱胁迫的诱导,但HcWRKY26过表达株系对盐和干旱胁迫处理更加敏感。:过表达HcWRKY26株系在平板处理和土培处理条件下均表现出对盐和干旱胁迫的敏感性。具体表现为在胁迫条件下过表达植株OE26的种子萌发受到抑制;根的生长受到盐胁迫的高度抑制,受干旱胁迫时根的生长被抑制;胁迫后植株的存活率较低等。此外,过表达株系OE26的种子萌发和萌发后的生长却对ABA不敏感。胁迫相关基因表达分析发现,在过表达株系中基因ABI1、ABI2、COR15A、COR47、DREB2A、RD29B和P5CS的表达上调;而ABI5、RD22和STZ的表达却被下调。其中,ABI1和ABI2表达上调或者ABI5表达下调会降低植株对ABA的敏感性,降低气孔闭合程度,导致植株耐受性降低。这与过表达HcWRKY26植株对盐和干旱胁迫的耐受性降低表型相一致。该结果表明HcWRKY26在参与应答盐和干旱胁迫反应中起着负调控作用。