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肝细胞癌是最常见的肿瘤之一，而转移复发则成为提高肝癌病人预后的主要障碍。为探索究竟何种细胞遗传改变的积累导致转移这一恶性表型的形成，复旦大学肝癌研究所在建立人肝癌转移模型(LCI-D20)基础上，成功建成了世界上首个高转移潜能的人肝癌细胞系MHCC97，并成功分离出具有不同转移潜能的细胞克隆MHCC97-H和MHCC97-L；这两种细胞经皮下接种、扩增成瘤、原位肝脏移植后肺转移率分别为100％和40％。最近又建成了具有更高转移力的细胞系HCCLM3，其细胞皮下接种后就发生了100％肺转移。这些细胞系和克隆为研究肝癌转移相关的细胞遗传学异常和分子标记提供了工具。 我所既往利用比较基因组杂交技术(CGH)在肝癌临床标本和对应转移灶中发现了8p缺失与肝癌转移有关；对高低转移模型LCI-D20和LCI-D35以及MHCC97-H细胞系的CGH分析进一步证实了这一发现。在此基础上，对22例临床标本杂和性缺失(loss of heterozygosity, LOH)的研究将缺失区域进一步缩小到8p23.3区和8p11.2区。 为查明我所新建立的这些具有同一遗传背景而又在肝癌的转移潜能上存在明显差异的细胞是否也具有8p的缺失，并弄清它们在其它染色体及其区段的DNA水平上有着怎样的相似和不同，这些相似与不同又有着怎样的意义，本课题联合应用G显带技术、比较基因组杂交技术(CGH)、多重荧光原位杂交技术(M-FISH)和位点或臂特异荧光原位杂交技术，对上述细胞进行细胞及分子遗传学研究，以期了解其分子细胞遗传学异常的特征、找出转移相关的遗传学标记，为探讨肝癌转移机制提供材料。 第一部分 以荧光原位杂交为基础的分子细胞遗传学技术平台的建立及其初步运用 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)及其相关分子细胞遗传学技术，国内仅少数实验室做的比较理想。本部分旨在我所建立以FISH为基础的分子遗传学技术平台。 首先以双色荧光原位杂交对高转移潜能细胞克隆MHCC97-H进行间接法FISH分析。采用商业途径获得的8号着丝粒探针和自己合成的来自8q23.1区的不同转移潜能人肝癌细胞模型的分子细胞遗传学研究博士论文摘要BAC探针进行FISH杂交，结果两种探针的穿透性、特异性和检测时的强度均较好。初步发现MHCC97一H克隆8号染色体呈三体性改变和其长臂信号向短臂区域易位及向B组染色体(4号染色体)的非交互性易位。 据此结果，利用购买的8号染色体特异性涂染探针(Whole chromosomepainting，WCp)，对MHCC97一H克隆进行杂交，不但优化了直接法探针的各项技术要点，还验证了双色FlsH的发现。 在双色FISH的基础上，我们建立了比较基因组杂交(Co哪arative genomichybridization，CGH)技术，并对低转移潜能或不转移的人肝癌细胞系SMMC一7721进行分析。CGH各项技术指标如目标片染色体长度，分裂像指数以及信号强度和均一性都达到默认设置。在SMMC一7721细胞系中检测出了扩增的区域有IP31，lq25，3P22一Pter， SP，6P21.3一Pter， 7P13一Pter， 8P23，SPll一q12，9q22一qter， 10P12一q21，11pter一qZI，llplZ一ql4，14ql3一qter， 15qls一qter， 17p，Xp14一pter;而缺失区域有4q31一35，gPZI一3，1 3qZI一31，18q，YqO 最后，我们探索了多重荧光原位杂交(Multiplex fluoreseenee in situhybridization，M一FISH)技术，并对HCCLM3细胞系进行分析。结果表明混合探针的特异性和亮度均可，发生了易位的标志染色体有der(Y)t( Y;18)，der(3)t(3:20)，der(4)(4;8)，der(9)t(9;13)，der(14)t(14:22)，der(15)t(15:21)，此外还观察到了X，1号和8号染色体内部的结构异常。 双色FISH、染色体涂染FISH、间接法CGH和MFISH技术的建立，为运用这些技术手段对不同转移潜能的细胞株和临床标本进行分子遗传学的分析及比较研究提供了条件。第二部分不同转移潜能的人肝癌细胞克隆的分子细胞遗传学分析 我们联合应用G显带技术、CGH、MFISH以及染色体臂和/或区域特异性荧光原位杂交技术(FISH)，对从MHCC97分离出的不同转移能力的细胞克隆MHCC97一H、MHCC97一L和HCCLM3进行分子细胞遗传学研究。发现: 1 .1(X)(qlo)，der(Y)t(y;18)(qlZ;Pll)，+der(3)t(3:20)(P25:ql3)， der(4)t(4;8)(q31:q22)，i(8)(qlo)，der(14)t(14:22)印13:ql3)等染色体异常在 三种细胞系中均出现，是其标志染色体，证实了它们的共同起源。 2.CGH发现三者各有其特异的遗传学改变特征，如+gqlZ一21，17q24一qter， 18q22一23，一13ql3，一13q22一31只出现在MHCC97一H中发生;而+Zq，+llq，尹不同转移潜能人肝癌细胞模型的分子细胞遗传学研究博士论文摘要 +9q33一ter只出现于MHCC97一L;+3qZI一24，+3q13.3一qter，+9p12一qter， +lopls，+12p，+17plZ一qlZ，+18pll.3一pter，+19p，一2p23一pter，等是HCCLM3 特有的改变。三种细胞中均存在8p23的缺失，而低转移或不转移的 sMMc一7721细胞8P区没有缺失;此外，我们利用改良的CGH方法， 发现在高转移的MHCC97一H细胞?