第一部分eIF3a基因多态性与肺癌患者铂类药物化疗反应的关系铂类药物的耐药性广泛存在,且极大地影响癌症患者的化疗成功率,是严重危害癌症患者生存率的重要因素之一。铂类药物一直以来,被认为是治疗包括肺癌在内的多种实体瘤的一线用药。而肺癌是所有癌症之中,死亡率最高的癌症类型,其五年生存率远远低其它恶性肿瘤。因此,如何提高肺癌患者中铂类药物治疗的有效性,将会对提高肺癌患者的化疗疗效,以及进一步延长其生存时间,起到非常重要的作用。与此同时,铂类药物普遍的各种毒副反应也极大的阻碍化疗的疗效。铂类药物的主要毒副作用有肾毒性、耳毒性、神经毒性、骨髓抑制以及消化道毒性等。但是无论是铂类药物的化疗疗效还是毒副反应的发生,其个体差异都非常大,如果能够发现有助于鉴别个体差异的生物学指标将会为提高铂类药物的有效应用引到一定的促进作用。从近年来分子水平的初步研究成果来看,单核苷酸修复途径(Nucleotide excision repair pathway, NER)是影响铂类药物化疗疗效的重要机制之一。最近的研究也表明,参与NER途径的重要基因相关的基因多态性也会对铂类药物的化疗疗效发挥一定的变异作用。eIF3a (Eukaryotic translation initiation factor3)属于NER途径的上游调控蛋白,它可以调节和控制NER途径的活性以及对于DNA的修复能力。细胞水平的研究发现eIF3a表达水平的高低可以影响细胞中DNA的修复能力的强弱。eIF3a是真核细胞转录起始因子eIF3组成部分中最大的亚单位。最近的研究表明,eIF3a在多种肿瘤细胞和肿瘤组织中呈现过度高表达,它与多种肿瘤的发生与发展过程密切相关。基于上述研究背景,本实验从以下两个方面进行了研究：(1)肺癌患者中eIF3a基因多态性或者基因突变是否与铂类药物的化疗敏感性或者耐药性相关；(2)eIF3a基因多态性或者基因突变是否与铂类药物的毒副反应相关。本课题的肺癌样本分别来自于中国内地三个不同省份和地区的四所临床医院,共收集了771例汉族人群中的肺癌患者的临床资料与外周血液标本。这些病人都是新近组织学或者细胞学确诊的肺癌患者,并且接受了2个疗程以后上铂类药物为主的化疗治疗。其中,282例非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)患者有完整的随访和生存资料信息。本研究共检测了eIF3a基因中的22个SNP位点。通过测序分析,我们发现了3个eIF3a的新突变等位基因,其中11279G>A的突变位于第6号内含子区,Arg438Lys突变位于第9位号显子区,29671G>A突变位于第15号内含子区。其相应的突变型等位基因的频率分别是0.16,0.18,和0.16。研究结果显示,eIF3ars3740556基因突变中,A等位基因携带者显示出了较好的铂类药物的化疗疗效(p<0.05),且A等位基因携带者显示了较长的生存时间p<0.05)。新发现的eIF3a Arg803Lys C>T基因多态性,在非小细胞肺癌患者中与铂类药物引起的严重毒副反应有明显的相关性(p=0.02,OR=0.54,95%CI[0.32-0.93])。同时,对于这个新发现的错义突变位点的进一步分析发现,T等位基因携带者对铂类药物引起的肾毒性有较好耐受性(p<0.05),但是更易受到耳毒性的影响(p<0.05)。综上所述,eIF3a基因多态性在肺癌患者中与铂类药物的化疗敏感性密切相关。其中,携带rs3740556突变A等位基因的肺癌患者疗效明显较好,并且生存时间显著延长；而新发现的eIF3a Arg803Lys错义突变则与非小细胞肺癌患者中铂类化疗药物的毒副反应密切相关。我们的这些研究为进一步阐明肺癌患者铂类药物化疗敏感性和毒副反应个体差异的遗传分子机制,以及对提高肺癌患者的化疗成功率和延长生存率提供了一定的科学依据。然而,elF3a基因多态性检测是否可以做为肺癌患者中预测铂类药物化疗疗效的有效方法,值得我们进一步的深入研究和大规模的临床验证。第二部分CTR1基因多态性与肺癌患者铂类药物化疗反应的关系铂类药物是被最广泛应用于抗患治疗的化疗药物之一,它可以用来治疗包括肺癌在内的多种实体瘤。但是,铂类药物疗效的巨大的个体差异极大的阻碍了铂类的临床效果。因此,关于铂类药物的耐药性以及毒副反应的各项研究一直是一个热门的研究方向。过去研究认为铂类药物在细胞内的摄取以及储存状况可以严重影响到铂类药物的化疗反应。新近的研究发现,铜离子蛋白转运家族是负责铂类药物从细胞外向细胞内转运和摄取的重要蛋白家庭,同时也与铂类药物的疗效以及和种毒副反应的发生有密切的相关性。而在为数不多的铜离子蛋白转运家庭成员中,CTR1蛋白(Copper transporter protein1)起到了最关键的作用,其相应的生物学效应也最为显著。药物基因组学的各项研究都表明,铂类药物生物学作用以及代谢过程中一些重要基因的基因多态性有可能会影响其药物反应性。本实验从以下两个方面进行了研究：(1)肺癌患者中CTR1基因多态性是否与铂类药物的化疗敏感性或者耐药性相关；(2)CTR1基因多态性是否与铂类药物毒副反应相关。本实验一共收集了282名汉族的非小细胞肺癌患者的外周血DNA标本,所有的患者都包含有完整的临床资料以及随访问的生存资料。这些患者都被明确诊断为非小细胞肺癌患者,而且接受了至少2个周期的铂类药物的化疗治疗。其中,204名患者接受了至少2个周期的顺铂类主的化疗治疗。而且另外的患者则是接受了以卡铂类主的化疗治疗。本实验一共检测了CTR1基因中的20个单核苷酸基因多态性突变位点。研究发现,CIR1基因中rs7851395与rs126863两个基因多态性位点在非小细胞肺癌患者中与铂类药物的化疗敏感性密切相关(p<0.05),且这两个基因位点组成的GT单倍型更易产生化疗的耐性性(p<<0.05),而AG单倍型则显示了更长的生存时间(p<0.05)。CTR1基因中的rs10981694多态性位点则与顺铂引起的严重毒副反应密切相关(p<0.05),其中C等位基因携带者对耳毒性的耐受性较差(p<0.05)。生存分析的结果则显示,rs10981694基因多态性并不能引起显著的生存时间的差异变化。综上所述,在汉族人群的非小细胞肺癌患者中,rs7851395与rs126863基因多态性与铂类的化疗敏感性显著相关,而携带有rs10981694多态性中的C等位基因的患者在接受顺铂治疗后更易产生耳毒性。CTR1在铂类药物的疗效差异性中起到了重要的作用,CTR1可能做为预测铂类化疗疗效和毒副反应的生物学指标。第三部分多西他赛对肺癌A549细胞中elF3a表达的影响eIF3a是真核翻译起始因子eIF3中最大的亚单位。许多研究表明,在酵母细胞和哺乳动物细胞中,eIF3a都参与了mRNA翻译的起始过程,并在蛋白质翻译起始过程中起重要调控作用。同时,eIF3a参与了细胞周期的调控,它与细胞的生长和分化存在着重要联系。eIF3a在细胞转录和翻译过程中起重要的调控作用,近年来研究发现eIF3a蛋白在肺癌组织中具有高表达。基因表达水平的改变或突变可能与肿瘤患者的生存率和化疗疗效有关。研究还发现eIF3a蛋白的过表达与肿瘤的分期、预后以及化疗敏感性有关。eIF3a蛋白过表达在肿瘤浸润的早期较晚期常见,在侵润性宫颈癌患者,较高eIF3a表达的宫颈癌患者比较低表达者预后要好。在乳腺癌和宫颈癌患者中,eIF3a表达较高者整体生存率也较高,我们最近的研究也发现,eIF3a在肺癌组织中蛋白的表达水平与肺癌患者顺铂化疗敏感性存在显著相关性,同时上调eIF3a在NIH3T3细胞中的表达量可以显著增加NIH3T3细胞对顺铂的敏感性。本实验的目的是探讨人类肺癌细胞株中,不同剂量的多西他赛在不同时间作用下对真核翻译起始因子eIF3a表达的影响。多西他赛为紫杉醇类抗肿瘤药,通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用。多西他赛可与游离的微管蛋白结合,促进微管蛋白装配成稳定的微管,同时抑制其解聚,导致丧失了正常功能的微管束的产生和微管的固定,从而抑制细胞的有丝分裂。多西他赛与微管的结合不改变原丝的数目。这一点与目前临床应用的大多数纺锤体毒性药物不同。主要适用于局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗,广泛应用在顺铂为主的化疗失败后的肺癌患者的治疗当中,同时也适用于局部晚期或转移性乳腺癌的治疗。实验选取人类肺腺癌细胞株A549,采用不同浓度的多西他赛(10μg/L,15μg/L,20μg/L,25μg/L and30μg/L)经过不同时间的处理(1h,2h,4h,6h,10h,12h, and24h),提取mRNA与蛋白质。采用Real-time PCR方法检测α-微管蛋白和eIF3a的mRNA表达水平,并同时用Western Blot方法检测α-微管蛋白和eIF3a的蛋白表达水平。结果发现,多西他赛不能调控α-微管蛋白的表达,且eIF3a与α-微管蛋白的表达水平之间没有明显的相关性。在高剂量(30μg/L)多西他赛处理细胞后,随着时间的延长eIF3a的mRNA表达水平有上升趋势。由些,我们得出结论,多西他赛在高剂量时具有增加eIF3a mRNA表达的趋势,并且eIF3a不能调控α-微管蛋白的表达。